2-хидроксипропил-β-циклодекстрин

  • абстрактно
  • Основното
  • методи
  • Животните.
  • Проучвателни групи.
  • HPpCD формулировки.
  • Тестване на предизвикания отговор на мозъчен ствол.
  • Статистически методи.
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Нормални котки.
  • Котки с NPC болест.
  • Нормални котки, получаващи траппсол.
  • ДИСКУСИЯ
  • Терминологичен речник

абстрактно

2-хидроксипропил-β-циклодекстрин (HPpCD) е обещаваща експериментална терапия за болест на Niemann-Pick тип С, която е подобрила вътреклетъчния транспорт на холестерол, значително е намалила невродегенерацията и чернодробните заболявания и е увеличила продължителността на живота на мишките npc1 -/-. Въз основа на благоприятния резултат от лечението при мишки, HPβCD се оценява като терапия при деца с болест на Niemann-Pick тип С (NPC). Оценихме ефикасността на HPβCD в котешки модел на NPC заболяване и установихме дозозависимо увеличение на свързаните с терапията прагове на слуха, както беше определено чрез тестване за предизвикан отговор на мозъчния ствол (BAER). За по-нататъшно оценяване на ефекта на HPpCD върху слуховия праг, на нормални котки се прилагат sc в доза 4000 mg/kg или 8000 mg/kg телесно тегло или интратекално в доза 4000 mg/kg мозъчно тегло. HPpCD причинява значително повишаване на прага на слуха след еднократна доза от 8 000 mg/kg подкожно или 120 mg интратекално и ефектът се запазва най-малко 12 седмици. Повтарящото се седмично sc приложение на 4000 mg/kg HPpCD седмично води до подобно повишаване на прага на слуха. Тези изследвания са първите, които описват специфичния отрицателен ефект на HPβCD върху слуховата система и предполагат необходимостта от тестване на слуха при пациенти, получаващи подобни дози HPβCD.

Основното

Циклодекстрините са циклични олигозахариди с хидрофобни вътрешности, които се използват като носители за увеличаване на количеството лекарство, включително хормони и витамини, което може да се разтвори във водни носители (1). 2-хидроксипропил-β-циклодекстрин (HPβCD) е широко проучен при гризачи, кучета и маймуни, където обикновено се понася добре при ниски дози (1, 2). Ежедневното iv приложение по-високо от 200 mg/kg причинява намалено телесно тегло, инфилтрация на пяна от макрофаги в белите дробове, повишени чернодробни ензими, повишени клетки на Kuppfer в черния дроб и бъбречна кортикална тръбна вакуолация при гризачи (1, 3, 4). Всички тези промени бяха обратими при прекратяване на HPβCD (1).

Естествената NPC се среща при котки, които имат дефектна мутация в NPC1 (2864G-C), с клинични, невропатологични и биохимични аномалии, подобни на тези, наблюдавани при пациенти в юношеска възраст, което прави този модел хомоложен на най-честата форма на заболявания. наблюдавани при хора (10, 11). Тестването на слуховия отговор на мозъчния ствол при БА с болест на НПК показва удължаване на времето за централна проводимост без значителна промяна в прага на слуха в сравнение с котки от див тип (11). Когато оценяваме ефикасността на HPβCD при лечението на NPC заболяване при котки, наблюдаваме значително увеличение на прага на слуха при животни, получаващи многократни дози от sc 4000 mg/kg. Доколкото ни е известно, отрицателният ефект на HPβCD върху слуховата функция не е оценяван при нито един вид. Това проучване изследва ефектите от sc и интратекалното приложение на HPβCD лечение върху BAER на нормални котки и котки с NPC заболяване.

методи

Животните.

Котките са били отглеждани в животински колонии в Университета на Пенсилвания в Училището по ветеринарна медицина, Националните институти по здравеопазване и USDA в съответствие с насоките за грижи за животните и изследвания. Експерименталният протокол беше одобрен от Комитета за институционални грижи и употреба в Пенсилвания към Университета в Пенсилвания.

Всички опитни животни са произведени от една и съща линия, която е отгледана за производство на котки с автозомно-рецесивно наследствено заболяване на Niemann-Pick тип С (NPC). Всички котки бяха настанени при 21 ° C с храна и вода ad libitum, 12-часови светлинни цикли, с 12 до 15 въздушни промени на час. Левкоцитите в периферната кръв от всички котки са тествани на 1-дневна възраст за неправилно усещане на NPC1 мутация с помощта на ДНК анализ, базиран на PCR (10). Котките с две копия на сензорната мутация бяха класифицирани като засегнати от NPC, докато котките с едно или никакво копие на мутацията бяха класифицирани като нормални. Хетерозиготно до хетерозиготно размножаване дава ∼ 25% от засегнатите и ∼ 75% от нормалното потомство.

Проучвателни групи.

Нормалните котки бяха поставени в една от петте проучвани групи (Таблица 1). Група 1 (n = 7) беше на 6 месеца и не получи никакво лекарство. Група 2 (n = 3) получи еднократна доза от 4000 mg/kg телесно тегло HPpCD sc на 6-месечна възраст. Група 3 (n = 3) получи еднократна доза от 8 000 mg/kg телесно тегло HPpCD sc на 6-месечна възраст. Група 4 (n = 3) получи еднократна доза от 4000 mg/kg мозъчно тегло (120 mg за 30 g мозъчно тегло) HPβCD интратекално на 6-месечна възраст. Интратекалното приложение е постигнато чрез анестезиране на котки с iv пропофол (до 6 mg/kg; Abbott Laboratories, Чикаго, IL). 20 g гръбначен мозък се поставя в церебеломедуларното казанче и 1,0 ml гръбначен мозък се отстранява. 0,6 ml 20% HPpCD във физиологичен разтвор се инжектират интратекално в малкия мозък цистерна. Група 5 (n = 3) е получавала 4000 mg/kg телесно тегло седмично HPpCD sc, започвайки от 8 седмична възраст, за общо седем дози.

Маса в пълен размер

Котките, засегнати от NPC, вече са участвали в клинично проучване, оценяващо ефикасността на HPβCD при лечението на заболяването. На всички котки е дадено лекарството най-рано на възраст от 3 седмици, преди появата на клинични признаци на заболяването и след това лекарството е продължено седмично. Котките бяха поставени в една от петте групи (Таблица 2). Група 6 (n = 8) не получи HPpCD и служи като контролна група за котки с NPC заболяване. Групи 7 (n = 5), 8 (n = 2) и 9 (n = 5) получават седмична доза от 1000 mg/kg HPpCD телесно тегло sc, 4000 mg/kg телесно тегло HPpCD sc и 8 000 mg/kg телесно тегло HPpCD sc, съответно. Група 10 (n = 2) получава 4000 mg/kg мозъчно тегло (120 mg за 30 g мозъчно тегло) HPpCD интратекално на всеки 2 седмици (интратекални пътища, описани по-горе).

Маса в пълен размер

HPpCD формулировки.

Всички HPβCD се прилагат в 20% (w/v) разтвор, разтворен в 0.9% натриев хлорид. HPpCD е получен от Sigma Chemical Co. и прахообразната форма (HPpCD-H107; Sigma Chemical Co. Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) се използва при всички sc администрации и във формата, тествана в клетъчна култура (HPpCD-C0926; Sigma Chemical Co. Aldrich) се използва за всички интратекално приложение. Като контрол за инжектиране на физиологичен разтвор, други нормални котки са инжектирани едновременно sc (n = 2) и интратекално (n = 2) с подобни обеми физиологичен разтвор.

За да се контролират възможни разлики между HPβCD, предлаган от Sigma Chemical Co., продукт, използван в публикувани проучвания върху мишки (8, 9), и одобрен от FDA състав за употреба при пациенти (клас Trappsol-Pharm, разработване на циклодекстринови технологии, Inc, High Извори). (FL), Trappsol е прилаган на четири котки: една доза от 8000 mg/kg телесно тегло sc (n = 2) и една доза от 4000 mg/kg мозъчно тегло интратекално (120 mg за 30 грама мозъчно тегло; n = 2).

Тестване на предизвикания отговор на мозъчния ствол.

При нормални котки проучвания BAER се провеждат през седмица след приложение на HPpCD в ​​групи 2, 3 и 4 общо 12 седмици и се провеждат всяка седмица в група 5 общо 12 седмици. При котки с NPC заболяване са проведени BAER проучвания на възраст 16 седмици.

Статистически методи.

Средните стойности и SD на предварително време, време на централната линия и V/I вълнови форми във всяка група са изчислени, за да опишат данните, и е използван несдвоен двустранен t тест за сравнение на данните между различните групи. Дадени са стойности на значимост на p

Представителни слухови речи, предизвикани от мозъчния ствол, предизвикаха реакции при нормални котки след приложение на HPβCD (група 2-5). Записите за групи от 2 до 4 са направени 2 седмици след еднократна доза лекарство. Записването за група 5 е направено една седмица след шестата седмична доза от лекарството. В групи 3, 4 и 5 се наблюдава намаляване на амплитудата на формата на вълната в сравнение с нелекувани котки (група 1). Промените в групи 3-5 бяха толкова тежки, че кривите не винаги можеха да бъдат надеждно идентифицирани (пример е даден за група 3).

Изображение в пълен размер

Праг на слуха, амплитуда на V/I вълна и централно време на проводимост бяха измерени за групи 1-5 (Таблица 3). Котките в групи 3 и 4 показват значително увеличение на прага на слуха 2 седмици след инжектирането в сравнение с неинжектираните котки (група 1). Средният праг на кликване върху BAER при контролни котки е 66 dB, докато в групи 3 и 4, които са лекувани с 4000 mg/kg и 8 000 mg/kg HPβCD, прагът се увеличава съответно до 79 и 81 dB. Тази приблизително 13 dB разлика между групите е била статистически надеждна (стр

Седмични прагове на слуха след 4000 mg/kg седмично приложение на HPβCD (група 5; n = 3). Първата доза е приложена веднага след тестване на прага за седмица 0. Повторното приложение на HPβCD води до прогресивно повишаване на слуховия праг със статистически значимо (p

Котките с NPC котки не показват повишаване на прага на слуха след седмично приложение на 1000 mg/kg HPβCD (група 7; n = 5) в сравнение с нелекувани засегнати котки (група 6; n = 8). И двете котки, лекувани седмично с 4000 mg/kg (група 8; n = 2), показват повишаване на прага на слуха, а котките, лекувани седмично с 8000 mg/kg (група 9; n = 5), имат статистически значими (p

Нормалните котки, лекувани с интратекален или sc Trappsol, показват абнормни криви 1 седмица след приложението. А показва мониторинг на BAER непосредствено преди интратекално инжектиране на 120 mg траппсол; B показва BAER в същата котка 1 седмица по-късно. С показва мониторинг на BAER непосредствено преди SC инжекция от 8000 mg/kg Trappsol; D, показва BAER в същата котка 1 седмица по-късно.

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

HPβCDs са циклични олигозахариди, състоящи се от седем β- (1-4) глюкопиранозни единици (7). HPpCDs имат хидрофилен екстериор и хидрофобен интериор, което ги прави полезни за увеличаване на разтворимостта във вода на хидрофобни молекули като холестерол, стероиди и витамини (20). Проучванията in vitro, използващи β-циклодекстрини, показват значително отстраняване на холестерола от култивирани невронални (21, 22) и неневронални клетъчни линии (23-25). Доказано е, че HPβCDs преминават през кръвно-мозъчната бариера in vitro (25) и in vivo (7, 26). Въпреки това, при проучвания с гризачи, β-циклодекстрините се прилагат безопасно интратекално и се използват за подобряване на доставката на лекарства в мозъка, включително анестетици, галанинов пептид и естрадиол (27-29).

Повишеният праг на слуха, без промяна на времето за централна проводимост, предполага, че HPβCD увреждане е настъпило в периферния слухов път (кохлея или осми нерв) и че възможните механизми на загуба на слуха включват директен ефект върху striae vascularis и ролята му за поддържане на йонната среда в ушна течност.пространство, трансдукция и локомоторни механизми на вътрешните и външните космени клетки и/или възбуждащите модели в изходите на слуховия нерв. Идентифицирането на мястото на действие на HPβCD в периферната слухова система вероятно ще бъде първата стъпка за преодоляване на токсичността на приложенията на HPβCD. Тестовете за акустични емисии биха били полезен метод за оценка на функцията на външните космени клетки при котки, но не са били налични за тези проучвания. В бъдеще трябва да се направи хистопатология на охлюви, за да се идентифицират всички патологични промени.

В обобщение, доказано е, че загубата на слуха след приложение на HPpCD е едновременно дозозависима и дълготрайна и може да бъде ограничаващ фактор при употребата на това лекарство във високи дози за лечение на болест на Niemann-Pick тип C. Препоръчва се тестване на слуха при пациенти, получаващи дози от 4000 mg/kg HPβCD или по-високи, за да се оцени ефектът върху прага на слуха при тези пациенти.