- елементи
- абстрактно
- Въведение
- резултатът
- Експресията на EcSOD отсъства в 2D култивиран HMEC
- Израз Генът EcSOD се реактивира в HMEC, култивиран в 3D
- 3D-култивираният HMEC показва по-ниски нива на окисление на DCFH в сравнение с клетките в еднослойна култура
- Тишина Генът EcSOD в 2D култивиран HMEC е свързан с хиперметилиране на промоторната ДНК
- Експресията на EcSOD е значително намалена в клиничните тъкани на рак на гърдата и неговите нива на експресия на mRNA корелират обратно на клиничния стадий
- Реекспресията на EcSOD инхибира образуването на звездни колонии от ракови клетки на гърдата в 3D култура
- EcSOD свръхекспресията потиска експерименталните белодробни метастази на клетки MDA-MB231 и удълженото оцеляване на животните
- EcSOD намалява скоростта на спонтанни метастази на аденокарциномни клетки на млечна млечна жлеза при сингенен миши модел
- дискусия
- Допълнителна информация
- Файлове с изображения
- Допълнителна фигура 1
елементи
- Рак на гърдата
- ДНК метилиране
- метастази
- оксидоредуктаза
абстрактно
Променената експресия на клетъчните антиоксидантни ензими, които метаболизират реактивни кислородни видове (ROS), често е нарушена при рака при човека. 1, 2, 3, 4 Такива антиоксидантни ензими включват SOD (супероксидни дисмутази), които премахват супероксид (O 2 -) и каталази, и глутатион пероксидази, които неутрализират водородния пероксид (H 2 O 2). Повреденото отстраняване на ROS води до прооксидативна среда, която благоприятства повишената пролиферация, оцеляване и онкогенна прогресия в раковите клетки. 1, 5 Наскоро демонстрирахме, че експресията на извънклетъчната супероксиддисмутаза (EcSOD) е значително потисната от аберантно метилиране на ДНК при около 80% от рака на белия дроб в сравнение с нормалните белодробни тъкани. 6 ДНК метилирането е един от епигенетичните механизми, свързани с аберантна генна експресия на туморни супресорни гени. Тъй като EcSOD е единственият поглъщател на кислород в белите дробове, очакваното нарастване на оксидативния стрес в микросредата на тумора в резултат на това инактивиране на експресията на EcSOD ще допринесе за патологичната и злокачествена прогресия на белодробния рак.
В сравнение с други SOD на бозайници, които са повсеместно експресирани, експресията на гена EcSOD е строго контролирана от клетъчен тип и тъканно специфичен начин. 8 Поради клетъчната повърхност и извънклетъчната локализация на EcSOD спрямо цитозолното и митохондриалното разпределение на CuZnSOD и MnSOD, специфичният модел на експресия на EcSOD подчертава различните биологични роли на тези SOD в тъканите. В нашето предишно проучване за рак на гърдата, свръхекспресията на EcSOD в EcSOD-нулеви клетъчни линии на рак на гърдата доведе до атенюирани злокачествени фенотипове in vitro, включително намален темп на растеж, клоногенно оцеляване и инвазия9, което предполага супресивна функция на EcSOD при рак на гърдата. За да се разбере по-добре ролята на EcSOD за поддържане на редокс хомеостазата на нормални епителни клетки на гърдата на гърдата и за предотвратяване на оксидативно медиирана туморогенеза на гърдата, е необходимо да се оценят нивата на експресия на този антиоксидантен ензим в нормални епителни клетки на гърдата спрямо злокачествени клетки. епителни клетки на млечната жлеза 6 повдигнаха фундаменталния въпрос дали EcSOD се експресира в нормални млечни епителни клетки.
За по-нататъшно справяне с този проблем с експресията на EcSOD в нормални епителни клетки на гърдата, ние извършихме имунохистохимично оцветяване (IHC) и сега потвърдихме експресията на EcSOD в епителните клетки на гърдата в нормална човешка тъкан на гърдата, за разлика от нашето предишно проучване in vitro, използващо култивирани клетки. Това несъответствие предполага, че експресията на EcSOD може да бъде нарушена, когато клетките се култивират като монослой в конвенционална двумерна (2D) културна система. Използването на триизмерна (3D) културна система наскоро набра скорост в проучванията за рак на гърдата, тъй като осигурява физиологично значимо състояние на тъканната култура за рекапитулация на много хистологични характеристики на епитела на гърдата in vivo. Те включват образуването на кухи лумени ациноподобни сфероиди, апикална поляризация на клетките и основно отлагане на компонентите на базалната мембрана, както и изобразяване на експресията на гени, специфично свързани с функцията на гърдата. 10, 11
Следователно целта на това проучване беше да се определи експресията на EcSOD в не-злокачествените епителни клетки на гърдата на гърдата, като се използва физиологично значима 3D културна система и да се определят механизмите, лежащи в основата на разликите в експресията на гена EcSOD в еднослойна култура спрямо ацинарна култура, както при клинично придобита рак на гърдата. Установихме, че организирането на тъканите е от съществено значение за експресията на гена EcSOD в не-злокачествените епителни клетки на гърдата на гърдата и че реактивирането на експресията на гена EcSOD в 3D култивирани клетки е свързано с епигенетично препрограмиране. Освен това> 80% от изследваните тумори на гърдата показват значително намалени нива на експресия на EcSOD в сравнение с нормалните тъкани на гърдата. Освен това показахме, че намалената експресия на EcSOD в тези тумори на гърдата е свързана с ДНК хиперметилиране в регулаторната област на EcSOD промотора. В нашите in vivo метастатични модели, животните, лекувани с аденовирусен вектор, свръхекспресиращ човешки EcSOD, AdEcSOD, показват значително намаляване на експерименталните белодробни метастази и спонтанни метастази в сравнение с празни мишки, третирани с вектор.
Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което показва "пластичността" на експресията на гена EcSOD в немагнитни човешки епителни клетки на млечната жлеза (HMECs) с крайна жизнеспособност при условия на 3D култура спрямо 2D клетки. Асоциацията на заглушаването на гена EcSOD със загубата на организация на тъканите на гърдата in vivo предполага важна роля за EcSOD като супресор на тумора на гърдата. Следователно, при определянето на нови терапевтични интервенции за това заболяване, ще бъде важно допълнително да се определи значението и механичната роля на EcSOD за потискане на прогресията на рака на гърдата.
резултатът
Експресията на EcSOD отсъства в 2D култивиран HMEC
За да определим ролята на EcSOD в развитието на рак на гърдата, ние оценихме нивата на експресия на EcSOD в култивирани не-злокачествени епителни клетки на гърдата. Както е показано на Фигура 1а, експресията на mRNA на EcSOD не се открива нито в HMEC, нито в MCF-10A клетки в сравнение с човешки белодробни MRC5 фибробласти и първични култури на човешки епителни клетки на дихателните пътища. Въпреки това, IHC оцветяването разкрива определено положително оцветяване на EcSOD в нормалните тъкани на гърдата, по-специално в млечния епител на гърдата (Фигура 1b). Тези наблюдения показват, че въпреки че нормалните епителни клетки на млечната жлеза демонстрират силна експресия на EcSOD in vivo, култивирането на клетките in vitro води до загуба на експресия на ген EcSOD.
Експресията на EcSOD се открива в нормална гръдна тъкан, но не и в не-злокачествени млечни епителни клетки в еднослойни култури. а ) Общата РНК беше извлечена и анализирана за транскрипция на EcSOD mRNA от HMEC след стаза, получена от редуциращи мамопласти и от спонтанно трансформирана не-злокачествена клетъчна линия на млечните епителни клетки MCF-10A. В сравнение с нормалните човешки белодробни фибробласти (MRC5) и нормалните човешки епителни клетки на дихателните пътища, клетките HMEC и MCF-10A показаха неоткриваема експресия на EcSOD иРНК, определена чрез RT-PCR анализ в реално време. 18S беше използван като контрол на натоварването. Лентите за грешки представляват тук, n = три отделни експеримента. б ) IHC анализът показва положително оцветяване на EcSOD в нормалната тъкан на гърдата (десен панел). В левия панел е показано H и E оцветяването на същата нормална гръдна тъкан.
Изображение в пълен размер
Експресията на гена EcSOD се активира отново в HMEC, култивиран в 3D
Изображение в пълен размер
3D-култивираният HMEC показва по-ниски нива на окисление на DCFH в сравнение с клетките в еднослойна култура
За да определим дали нивата на оксидативен стрес се променят, когато HMECs се култивират при 2D условия в сравнение с 3D културата, маркирахме клетките с чувствителна към окисляване флуоресцентна сонда, DCFH. Повишено окисление на DCFH се наблюдава в 2D култивиран HMEC в сравнение с 3D култивирани клетки, както е показано чрез анализ на поточна цитометрия на Фигура 3а (средна интензивност на флуоресценция 2102 в 2D HMEC срещу 189 в 3D HMEC). Нечувствителната към окисляване версия на тази сонда, която контролира усвояването на багрилото, разцепването на естераза и изтичането, не показва разлика в интензитета на сигнала, което показва, че разликите в сигналите, наблюдавани между 2D и 3D култури, се дължат конкретно на окисляването на сондата (данните не са показани). Това предполага, че разпространението на не-злокачествени епителни клетки на гърдата като монослойна култура е довело до повишен оксидативен стрес, който може да се отдаде отчасти на загубата на експресия на EcSOD.
Изображение в пълен размер
Заглушаването на гена EcSOD в 2D култивиран HMEC е свързано с хиперметилиране на промоторната ДНК
Експресията на EcSOD е значително намалена в клиничните тъкани на рак на гърдата и неговите нива на експресия на mRNA корелират обратно на клиничния стадий
Също така се опитахме да определим нивата на експресия на EcSOD в клинични проби от рак на гърдата. Както е показано в представителни изображения на EcSOD IHC оцветяване на Фигура 4а, ние открихме силна и окончателна експресия на EcSOD протеин в епителните клетки на млечната жлеза в доброкачествената лобула. За разлика от това, имунореактивността на EcSOD е значително намалена при силно дуктален карцином in situ и при инвазивен рак на гърдата. Интензивността на IHC оцветяването за EcSOD в нормални срещу неопластични тъкани на гърдата е полуколичествена и е показана в Таблица 1. За по-нататъшно изследване дали нарушената експресия на EcSOD е често срещано събитие при рак на гърдата, проведохме поле за cDNA на рак на гърдата TissueScan (Origene, Inc ., Rockville, MD, САЩ). Както е показано на Фигура 4b, е имало спад в нивата на експресия на mRNA на EcSOD на етап I и значително намаляване на етап II до IV в сравнение с нормалните тъкани (Р
Свръхекспресията на EcSOD инхибира образуването на звездни колонии от MDA-MB231 клетки в 3D култура. Двуизмерни култивирани MDA-MB231 бяха заразени с AdEmpty, AdEcSOD или AdAHBD, при moi = 50 PFU/клетка за 24 часа, последвано от повторно засяване на клетките в 3D култура. След 5 дни 3D култура, клетките MDA-MB231 образуват големи колонии с обширни звездни структури, отличителен белег на триизмерния фенотип на "инвазивния" рак на гърдата. Въпреки че AdEmpty не е повлиял на 3D морфологията на тази клетъчна линия, свръхекспресията на EcSOD, както в пълна дължина, така и в пресечени форми (с AdEcSOD и AdAHBD аденовирусна инфекция, moi = 50 PFU/клетка), води до много по-малки колонии без формиране. морфологична промяна се наблюдава, когато MDA-MB231 клетки се генерират, за да експресират стабилно EcSOD, при Ec.20 (пълна дължина) и AHBD.3 (делеция в HBD), където клетките образуват малки колонии при липса на удължаване на звезда. Представителни микрографии N = 3. Мащаб на колона = 100 μm.
Изображение в пълен размер
EcSOD свръхекспресията потиска експерименталните белодробни метастази на клетки MDA-MB231 и удълженото оцеляване на животните
Потискане на белодробните метастази от MDA-MB231.luc клетки от EcSOD. За да се индуцират белодробни метастази, 2 x 106 MDA-MB231.luc клетки се инжектират в страничната вена на опашката при голи атимични мишки. Свръхекспресията на EcSOD е постигната с AdEcSOD или AdAHBD (1 х 10 10 PFU), приложени интрамускулно 3 дни преди инжектиране на ракови клетки на гърдата. AdEmpty беше използван като векторна контрола. ( а, Горен панел) Представителни биолуминесцентни изображения на мишки, направени веднага след инжектиране на клетки MDA-MB231.luc. ( а, Долен панел) Мишките се изобразяват дорзално и вентрално седмично, за да се наблюдават метастази в клетки на рак на гърдата. Групите, лекувани с EcSOD, показват намалено развитие на белодробни метастази в сравнение с заразената с AdEmpty група. Ето изображения на времевия ход от едно и също животно във всяка група. ( б ) Луминесцентният сигнал (фотонен поток) на метастатични клетки MDA-MB231.luc е начертан с течение на времето, показвайки значително инхибиране на белодробните метастази от AdEcSOD и AdAHHD спрямо AdEmpty (P
Инхибиране на спонтанни метастази в клетъчната линия на карцинома на гърдата чрез EcSOD. а ) Представителни изображения на биолуминесценция, показващи прогресията на клетки от карцином на гърдата на мишки 4T1.luc при мишки BALB/c на ден 10 след имплантиране на тумор (1), 7 дни след отстраняване на тумора (2) и метастази в белите дробове и лимфните възли на 4 седмици след тумора премахване (3). б ) Появата на метастази на 4T1.luc клетки във вторични места (бели дробове и лимфни възли) беше оценена и показана като процент от метастазите. ( ° С ) Степента на преживяемост на животни от Kaplan-Meier, трансдуцирани с AdEmpty, AdEcSOD и AdAHBD, е начертана, използвайки статистика на Prism с изминали дни след хирургично отстраняване на първичните 4T1.luc тумори. Кривата на оцеляване за AdEcSOD и AdAHBD се различава значително (P 15, който по-късно предполага, че секретираният SOD може да играе важна роля за поддържане стабилността на млечния протеин чрез предотвратяване на оксидативно увреждане на протеина. 16 Тук убедително демонстрирахме експресията на EcSOD в нормалната човешка млечна жлеза и тази луминална епителните клетки вероятно ще бъдат източник на екскреция на този ензим в млякото.
Освен това показахме, че HMEC губи експресия на EcSOD, когато се култивира като монослой и тази промяна се регулира от епигенетичен механизъм, при който метилирането на EcSOD промоторната ДНК област се случва в 2D култивиран HMEC (Фигура 3d). Хиперметилирането на CpG островчета в промоторната област на гена се признава като важен епигенетичен механизъм на транскрипционно заглушаване на туморни регулаторни гени, в много случаи на туморни супресорни гени, по време на развитието на рака. Фактът, че експресията на гена EcSOD се контролира плътно по специфичен за клетка тип 8 и неговият промотор показва CpG структура, подобна на друг ген, заглушен от аберантно метилиране на цитозин 18, предполага възможна асоциация на епигенетична регулация чрез метилиране на ДНК с EcSOD ген. експресия в млечните епителни клетки. Затихването на гена EcSOD чрез метилиране на ДНК е обратим процес, като морфогенеза на акрар, медиирана от lrECM HMEC, индуцирано реактивиране на експресията на EcSOD ген в 3D култивиран HMEC.
Важно е да се отбележи, че моделът HMEC, използван в това проучване, е получен от търговски източник, който е претърпял стазис или предизвикано от стрес стареене. 19 Въпреки че тези HMEC пост-стадове все още имат ограничен живот и не са злокачествени, е доказано, че са придобили стотици транскрипционни и епигенетични промени по време на процеса на подбор. 20, 21 Това предполага, че загубата на експресия на EcSOD, наблюдавана в нашия 2D култивиран HMEC, може да е била инициирана по време на клетъчна прогресия чрез това предизвикателство на стаза и че клетките преди етапа все още могат да запазят експресията на EcSOD.
Наблюдението, че загубата на млечна тъкан (както при еднослойната култура на HMEC) насърчава епигенетично заглушаване на EcSOD, също се подкрепя силно и е отразено в нашите клинични данни, като повечето тумори на гърдата показват значително намалени нива на експресия на EcSOD в сравнение с нормалната тъкан на гърдата. Регионът, анализиран чрез анализ на COBRA (Фигура 4в), отговаря на регулаторното място за транскрипционните фактори SP1/SP3, за които е доказано, че са движещата сила за експресията на EcSOD и които наскоро установихме, че са хиперметилирани в нашите проучвания за рак на белия дроб. Метилирането на CpG места в този регион пречи на свързването на тези транскрипционни фактори и създава по-затворена хроматинова структура, което води до репресивно състояние на експресията на EcSOD.
Като цяло, това проучване ясно демонстрира експресията на EcSOD в нормални епителни клетки на гърдата in vivo и в 3D култивирани HMECs. Въпреки това, ако лобуларната архитектура се наруши, например при тумори на гърдата и в HMEC култивиран монослой, EcSOD генът се заглушава чрез отклоняващо метилиране на цитозин. Тези вълнуващи наблюдения също така предполагат, че повишената активност на поглъщане на ROS, например с миметици на SOD, може да бъде изследвана като терапевтична стратегия за метастатичен рак на гърдата. По-нататъшното потвърждаване на причинната роля на заглушаването на гена EcSOD за насърчаване на прогресията на рака на гърдата и метастазите ще бъде от решаващо значение при идентифицирането на загубата на експресия на EcSOD като предсказващ биомаркер за ранна диагностика и нови лечения.