елементи
абстрактно
Алдостеронът е минералокортикоиден хормон, произведен в надбъбречната кора. При физиологични условия свързването на алдостерон със специфични вътреклетъчни минералокортикоидни рецептори (MR) в дисталния нефрон регулира холеостазата на електролитите и водата. По този начин алдостеронът регулира обема на кръвта и кръвното налягане. Въпреки това, алдостеронът също допринася за развитието на бъбречно увреждане, както се съобщава в няколко проучвания. Първичният алдостеронизъм, характеризиращ се с високи плазмени нива на алдостерон и ниска активност на ренин, често е свързан с повишен риск от бъбречно увреждане. 5
Cry1,2 DKO мишки бяха използвани за изследване на индуцирано от алдостерон бъбречно увреждане при липса на предишна бъбречна манипулация, лечение с висока сол и/или приложение на минералокортикоиди. Известно е, че криптохромът регулира циркадните ритми. 14 Cry1, 2 DKO мишки показват повишена експресия на иРНК и нива на протеин на 3β хидроксистероидна дехидрогеназа, ензим, участващ в синтеза на алдостерон. Ензимът се експресира главно в зона гломерулоза, където е известно, че се случва изключително производството на алдостерон. По този начин мишките Cry1,2 DKO показват високи нива на алдостерон, но ниска плазмена активност. 15
методи
Експерименти с животни
В това проучване използвахме криптохромно-нулеви мишки (Cry1, 2 DKO), които се характеризират с високи плазмени нива на алдостерон и потискане на рениновата активност. Развитието на Cry1,2 DKO мишки е описано по-горе. По време на проучването всички мишки се поддържат при стабилна околна температура с 12-часов цикъл светлина-тъмнина и имат свободен достъп до вода и храна. Всички експериментални протоколи са извършени въз основа на експерименти с животни в университета Кобе, Япония.
Използвахме мишки Cry 1, 2 DKO и стандартни (WT) братя и сестри като контроли. Разделихме 12-седмични мъжки мишки на следните шест групи: WT мишки, получаващи нормална обработка със сол (WTNS; n = 17), WT мишки, получаващи висока сол обработка (WTHS; n = 16), Cry1, 2 DKO мишки, получаващи нормални третиране със сол (CRYNS; n = 13), мишки Cry1, 2 DKO, получаващи високо съдържание на сол (CRYHS; n = 20), мишки Cry1, 2 DKO, получаващи лечение с високо съдържание на сол и спиронолактон (CRYSPI; n = 13); ) и Cry1, 2 DKO мишки, получаващи високо съдържание на сол и хидралазин (CRYHYD; n = 6). Всички мишки са били подложени на подходящо лечение в продължение на 32 седмици. Нормалната солена диета има съдържание на NaCl от 0,2%, докато диетата с високо съдържание на сол съдържа 3,15% NaCl, а питейната вода съдържа 1% NaCl и 0,2% KCl. Спиронолактон или хидралазин се прилагат в питейна вода. Дозите на спиронолактон (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и хидралазин (Sigma-Aldrich) са 6 mg kg-1 телесно тегло на ден и 25 mg kg-1 телесно тегло на ден. Спиронолактонът се разтваря в етанол и след това се разрежда в питейна вода.
Измерване на кръвното налягане
Кръвното налягане се определя при съзнателни, обучени мишки, използвайки неинвазивна компютърно автоматизирана система за маншети за опашка (BP-98A, Softron, Токио, Япония). За анализ на данните е използвана средна стойност от 10 измервания.
Биохимичен анализ на кръв и урина
След 32 седмично лечение се получава кръв за биохимичен анализ чрез сърдечна пункция преди мишките да бъдат умъртвени. Събирането на 24-хурина се извършва с метаболитни клетки 1 ден преди убиването на мишките. Концентрациите на креатинин в серума и урината бяха измерени с помощта на ензимен анализ (Nescoat VLII CRE Kit; Alfresa Pharma Corp, Осака, Япония). За измерване на албумин в урината (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) съгласно инструкциите на производителя е използван търговски достъпен ензимно-свързан имуносорбентен тест. Серумният алдостерон се измерва, като се използва търговски наличен ензимен имуноанализ (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA, USA) съгласно протокола, описан от производителя. Електролитите в серума и урината бяха измерени с помощта на йонселективен електрод и изчислени с помощта на уравнението на Nernst.
Генната експресия
Общата РНК от отстранения бъбрек беше извлечена с помощта на RNAIsoPlus (TaKaRa, Dalian, Китай). Обратната транскрипция беше извършена с помощта на ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) в съответствие с инструкциите на производителя. Количественото определяне на нивата на експресия на ренин, MR, 11β хидроксистероидна дехидрогеназа тип 2 (11BHSD2), нефрин и глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа (G6PD) се извършва с помощта на Thunderbird SYBR qPCR Mix (Тойобо, Осака, Япония) съгласно описания протокол. производител. Праймерите, използвани в това проучване, бяха както следва: ренин (напред: 5'-ATGAAGGGGGTGTCTGTGGGGTC-3 '; обратен: 5'-ATGTCGGGGAGGGTGGGCACCTG-3 ′), MR (напред: 5′-GGAAACCAAAGGCTACCACA-3G' GACTAC-3G 'GACTAC-3G' GACTAC ' ′), 11BHSD2 (напред: 5′-TTTGGTGCACTTGAGCTGAC-3 ′; реверс: 5′-GGTATGGCATGTCTCCTGCT-3 ′), нефрин (напред: 5′-ACTACGCCCTCTTCAAATGCA-3 ′; назад: 5G-TCC, GAC: 5G-TCC, GAC: 5G-TCC, GAC 5′-GTTAAATGGGCCAGCGAAG-3 ′; реверс: 5′-CCTGCTCTGCCATGATGTTT-3 ′) и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (напред: 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ TGGA: 5′GG: 5′G.
Количествено определяне на хистопатологията
Оценка на производството на реактивни кислородни видове
Оценката на реактивните кислородни форми (ROS) беше извършена върху оцветени с дихидроетидий криосекции. Накратко, криосекциите се инкубират с 5 цМ дихидроетидий в диметилсулфоксид при 37 ° С в продължение на 30 минути. Количественото определяне на интензивността на дихидроетидия се извършва, като се използват 15 зрителни полета при увеличение 200x.
Статистически анализи
Всички данни са представени като средно ± sem. Предполагахме, че групите обикновено не са разпределени. Затова направихме статистически анализ на няколко групи, използвайки непараметричния тест на Крускал-Уолис, последван от U-теста на Ман-Уитни между двете групи. Стойността на P19 също е измерена чрез експресия на 11BHSD2 в целия бъбрек. Въпреки това не наблюдавахме разлика в експресията на 11BHSD2 между различните групи (фигури 1в и г).
Концентрация на алдостерон в серума ( а ) и ренин ( б ), минералокортикоиден рецептор (MR) ( ° С ) и експресия на иРНК 11pHSD2 (11BHSD2) ( д ). Нивата на серумен алдостерон са измерени при пет до девет мишки. ( б - д ) Графиките представят съотношението между експресията на иРНК и експресията на иРНК на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) в целия бъбрек (n = 4). Данните са представени като средно ± sem * P
Систолично кръвно налягане, измерено при съзнателни мишки, използвайки метода на маншета на опашката. Данните са представени като средна стойност ± sem n = 6-14. * Р
Креатининов клирънс ( а ), албуминурия ( б ), серумен калий ° С ), серумен натрий д ), нивото на калий в урината д ) и нива на натрий в урината ( е ) мишки след 32 седмично лечение. Данните са представени като средна стойност ± sem n = 6-13. * Р
Представителни изображения на периодично киселинно-шифово (PAS) оцветяване на тубуларната област, Sirius червено оцветяване на тубуларната област и GAS оцветяване на гломерулната PAS област ( а ). Графиките представляват количественото определяне на оценката на тръбните увреждания ( б ), гломерулосклероза ° С ) и тубуларна интерстициална фиброза ( д ). Тръбното увреждане е идентифицирано чрез PAS оцветяване на тръбната област като тръбна вакуолация (стрелка) и загуба на ръба на четката (стрелка стрелка). Данните са представени като средна стойност ± sem n = 6-14. * Р
Експресия на нефрин. а ) Представителен образ на имунофлуоресцентно оцветяване с нефрин и б ) количествено определяне на сигнала като процент от гломерулната площ (n = 5–10). ( ° С ) Графиките представляват съотношението между експресията на иРНК и експресията на иРНК на GAPDH (п = 5-7). Данните са представени като средно ± sem * P
Оцветяване с дихидроетидий (DHE) ( а ), количествено определяне на DHE оцветяване б ) и експресия на иРНК на глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа (G6PD) ( ° С ). Количествено определяне на DHE оцветяването беше извършено върху пет проби от всяка група. ( а ) DHE-положителното оцветяване показва червено флуоресцентно оцветяване върху клетъчното ядро в гломерулната (G) и тубуларната (T) области. ( б ) Количествено определяне на интензитета на DHE оцветяване. ( ° С ) Графиките представят съотношението между експресията на иРНК на G6PD и експресията на GAPDH иРНК (п = 6-11). Данните са представени като средно ± sem * P 20, 21, 22 Следователно, хипертонията не трябва да се използва като предпоставка за първичната диагноза на алдостеронизма. Предполага се също така, че нормокалиемията не трябва да изключва възможността за първичен хипералдостеронизъм. 23.
Отбелязахме, че Cry1, 2 DKO мишки в това проучване развиват албуминурия след нормално лечение със сол и при липса на повишено кръвно налягане. Алдостеронът проявява ефекта си чрез свързване с MR. MR се експресира в бъбреците главно в дисталните каналчета и в събирателните канали. По-ниска експресия на MR е съобщена при гломерули, особено в мезангиални клетки 25 и подоцити 26, при които алдостеронът може да действа директно. Установено е, че при едностранни нефректомизирани плъхове, на които е прилагано лечение с алдостерон и високо съдържание на сол, протеинурията е свързана с намалени нива на нефрин, свързан с подоцити протеин. 26 Нефринът се експресира специално в мембранната мембрана на подоцитите и следователно играе важна роля във функцията на гломерулната филтрационна бариера. В това проучване наблюдавахме, че мишките Cry1, 2 DKO показват намалени нива на експресия на нефрин. Следователно ние предлагаме, че намаляването на експресията на нефрин при мишки Cry1,2 DKO води до нарушаване на гломерулната филтрационна бариера и по този начин поне частично влияе върху нивата на албумин в урината.
В сравнение с животински модели, комбиниращи едностранна нефректомия с висока експозиция на сол и минералокортикоиди, където относително краткосрочното лечение (4-8 седмици) причинява тежко бъбречно увреждане, включително гломерулосклероза и бъбречна фиброза, 8, 12 бъбречно увреждане, наблюдавано при нормална сол. лекуваните Cry1, 2 DKO мишки в продължение на 32 седмици са по-малко тежки. В допълнение, дори след 32 седмици лечение с висока сол, мишки Cry1, 2 DKO не развиват гломерулосклероза или интерстициална фиброза. Въз основа на тези наблюдения не можем да изключим, че хроничният ендогенен хипералдостеронизъм може да предизвика адаптивни механизми, които биха могли да ограничат вредните ефекти на алдостерона. Тези резултати могат да отразяват клинични находки при пациенти с първичен алдостеронизъм, които често имат микроалбуминурия и повишена скорост на гломерулна филтрация 31, които могат успешно да бъдат лекувани или с адреналектомия, или с MR блокер терапия. 32, 33, 34 Освен това се смята, че тежкото увреждане на бъбреците се развива след няколко години. 35
Като се има предвид ролята на криптохромите в циркадния ритъм, ефектът от делецията на криптохром при мишки Cry1,2 DKO не може да бъде пренебрегнат. Повишените нива на албумин в урината, намалената експресия на нефрин и увеличеното производство на ROS при високо третирани със сол CRYHS мишки бяха инхибирани от лечение със спиронолактон. По този начин предположихме, че бъбречното увреждане при мишки Cry1, 2 DKO е свързано с хипералдостеронизъм.
И накрая, нивата на експресия на нефрин и продукцията на ROS при мишки в групата, лекувана със спиронолактон, са по-добри, отколкото в групата CRYNS и сравними с тези в групата WTNS. В допълнение към инхибирането на комбинирания ефект на хипералдостеронизма и солта, спиронолактонът може също да потисне ефекта само на хипералдостеронизма.
В заключение, нашето проучване показа, че вредното въздействие на алдостерона върху бъбреците може да е независимо от излагането на високи соли и високо кръвно налягане, но лечението с високо съдържание на сол влошава тези ефекти. Въз основа на нашите открития ние предполагаме, че контролът на кръвното налягане може да не е достатъчен за защита на бъбреците при първичен алдостеронизъм; в такива случаи обаче достатъчното блокиране на алдостерона може да е достатъчно за защита на бъбреците.