елементи
абстрактно
Основното
С бързото увеличаване на използването и продължаващия напредък в напречното сечение на коремните образи, откриването на кисти на панкреаса става все по-често. Съобщава се, че кистите на панкреаса се идентифицират при 1,2% до 2,6% от коремната компютърна томография. Разпространението се увеличава с възрастта и до 24% от пациентите при аутопсия имат панкреатични кисти. 3 В миналото се смята, че псевдокистите представляват по-голямата част от панкреатичните кисти, но повечето от тези лезии са кистозни новообразувания. Много от тези новообразувания, включително серозните цистаденоми, са доброкачествени и могат да бъдат наблюдавани клинично. За разлика от тях, интрадукталните папиларни муцинозни неоплазми (IPMN) и муцинозни кистозни новообразувания (MCN) имат потенциал да прогресират до инвазивен аденокарцином на панкреаса. 4, 5, 6, 7 Впоследствие са разработени и наскоро актуализирани международни консенсусни насоки за управление на IPMN и MCN. 8, 9 Следователно точната диагноза е от решаващо значение за правилната грижа за пациента.
След проучването PANDA ние интегрирахме мутационен анализ на KRAS като част от рутинната оценка на кистозните новообразувания на панкреаса. В тази статия ние докладваме нашия клиничен и патологичен опит с тестването на KRAS, за да: (1) идентифицираме разпространението на мутации на кисти при голям обем на услуга на киста на панкреаса; (2) оценка на ролята на KRAS тестването за диференциране на муцинозни от немуцинозни кисти; и (3) корелира KRAS анализа с други приети диагностични методи при диагностицирането на кистозни панкреатични новообразувания.
Материали и методи
дела
Одобрението на изследването е получено от Институционалния съвет за преглед на университета в Питсбърг. Данните бяха събрани във всички случаи, когато кистозна течност на панкреаса беше приложена в Медицинския център на Университета в Питсбърг, отдел по молекулярна анатомична патология за анализ на KRAS. Ендоскопска ултразвукова аспирация, получена от фина игла, е получена от пациенти, наблюдавани в медицинския център в Питсбърг от ноември 2006 г. до октомври 2012 г. Във всички случаи пробите бяха представени с ендоскоп поради несигурност дали кистата на панкреаса е кистозна неоплазма.Например, пациентите с псевдокисти, които имат документирана анамнеза за коремна травма, често са били изключвани от приложение на течности. Пациенти с високо клинично подозрение за IPMN от основен канал чрез ендоскопия и образи също се въздържат от анализ, тъй като допълнителното тестване няма да повлияе на управлението на пациентите. Прегледани са медицински досиета, за да се документират демографски данни на пациентите, находки от ендоскопски ултразвук, вискозитет на течността (както е записано от ендоскопа), анализ на CEA и цитопатологични диагнози.
По време на ендоскопската ултразвукова аспирация с фина игла, ако течността на кистата на панкреаса е приблизително 750 μl или повече, най-малко 500 μl първо се разлагат за анализ на CEA, 200 μl за молекулярен анализ и останалата част за цитология, което включва изплакване на иглата . В някои случаи се оценява и амилаза. В случаите, когато има 200 до 750 μl кистозна течност, приоритет се дава на цитологията, която включва изплакване на иглата и 200 μl за молекулярен анализ; за CEA не беше подадена течност поради недостатъчна течност за анализ. 9 Предвид сроковете на проучването, наскоро публикуваните насоки на Международния консенсус от 2012 г. не се прилагат стриктно при оценка на критериите за операцията. След резекция бяха изследвани оцветени с хематоксилин и еозин предметни стъкла, за да се потвърди хистологичната диагноза или да се оцени степента на дисплазия и да се класифицира хистологичният подтип на резецирани IPMN. 13
CEA анализ
Нивата на CEA на панкреатичната киста се оценяват чрез двустаен имуноензимен анализ "сандвич", като се използват две моноклонални анти-CEA антитела, които реагират с различни CEA епитопи. Този анализ беше извършен на Beckman Coulter Unicel DXI 800. Преди анализа пробите бяха центрофугирани в продължение на 2 часа и в реакционния съд бяха добавени най-малко 500 μL (оптимално 1 ml) безклетъчна проба. Във всички случаи тестването се извършва в рамките на 24 часа след аспирация на фина игла на кистата на панкреаса. Количеството CEA, присъстващо в пробата, беше определено чрез съхранена многоточкова калибрационна крива.
KRAS мутационен анализ
Общата ДНК на генома беше изолирана от 200 μl цистозна течност чрез разделяне на колона съгласно инструкциите на производителя (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Количеството изолирана ДНК се определя с помощта на спектрофотометър NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). За откриване на мутации 10-50 ng ДНК се амплифицират с праймери, фланкиращи екзон 2 на гена KRAS (директен праймер 5'-GGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 'и обратен праймер 5'-TCCTGCACCAGTAATATGCA-3') и екзон 3 'на гена KRAS TGAAGTAAAAGGTGCACTG-3 'и обратен грунд 5'-GCATGGCATTAGCAAAGACTC-3'). След това, PCR продуктите бяха секвенирани както в смисъл, така и в антисенс насоки, използвайки комплекта за циклично секвениране BigDye Terminator v3.1 на ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Последователните електроферограми бяха анализирани с помощта на софтуера Mutation Surveyor (SoftGenetics, LLC, State College, PA, USA). Всеки случай е класифициран като положителен или отрицателен за KRAS мутация въз основа на резултатите от секвенирането.
Статистически анализ
Статистическият анализ за оценка на разликите между KRAS-мутантни кисти и CRAS-тип плъхове беше сравнен, използвайки точния тест на Fisher за дихотомични променливи. Всички тестове бяха двустранни и статистическата значимост беше определена като P стойност
KRAS- мутантно клонче, интрадуктална папиларна муцинозна неоплазма (IPMN). а ) Анехогенни и септични кисти са идентифицирани в тялото на панкреаса чрез ендоскопски ултразвук. Кистата измерва 1,8 cm в максимален напречен диаметър и не комуникира с главния канал. При аспирация с фина игла се установи, че течността е леко вискозна. б ) Цитологичните цитонамазки са по-малко от оптимални и показват предимно муцин с редки хистиоцити и лимфоцити. Пациентът е претърпял дистална панкреатектомия поради случаен панкреатичен невроендокринен тумор, но кистата ( ° С, д ) съответства на разклонения канал, IPMN с нискостепенна дисплазия и стомашна лигавица.
Изображение в пълен размер
Общо 25 от 89 (28%) KRAS тип кисти са IPMN или IPMN-свързани аденокарциноми. Това включва 10 (40%) IPMN на разклонения канал, 7 (28%) IPMN на основен канал, 3 (12%) смесени основни и разклонени IPMN канали и 5 (20%) свързани с IPMN аденокарциноми. Въз основа на хистологичния подтип, 12 (48%) са стомашни, 9 (36%) чревни и 4 (16%) панкреатобилиарни. Подобно на KRAS мутантните IPMN, нискостепенната дисплазия (11 от 25, 44%) е по-разпространена, последвана от умерена (n = 8, 32%) и висока (n = 6, 24%). Отново по отношение на адекватността на пробата като фактор за оценка на състоянието на мутация на KRAS, 12 от 25 (48%) CRM тип IPMN в сравнение с 21 от 50 (42%) мутантни KRAS IPMN са по-малко от оптимални или незадоволителни за цитопатологичния статус. диагноза.
Сред резецираните IPMNs няма корелация между статуса на KRAS и пола на пациента (P = 0,22), средната възраст (P = 0,60), средния размер на кистата (P = 0,52), местоположението на кистата (P = 0,46)., Кистозна фокална (P = 0.63), вискозитет на течността (P = 1.00), нива на CEA (P = 0.36) или средна концентрация на ДНК (P = 0.96). Разпространението на KRAS мутациите обаче е по-високо при IPMN, което включва разклоняване (P = 0,03), стомашен хистологичен подтип (P = 0,01) и ниска степен на малка дисплазия (P = 0,01). В допълнение, липсата на мутации на KRAS корелира с IPMN от чревен тип (P = 0,04).
Муцинозни кистозни новообразувания
Всичките 22 MCN са идентифицирани при жени на възраст от 20 до 75 години (средно 46, 9 години). Кистите са измерени от 2,0 до 9,9 cm (диаметър, 4,5 cm) и са поставени в дисталния панкреас. Петнадесет (67%) са в опашката на панкреаса, докато 7 (33%) са в тялото. Ендоскопската ултразвукова аспирация с фина игла показа, че кистозната течност е тънка и водниста в 10 (45%) случая и вискозна в 12 (55%). Анализът на CEA е извършен на 21 от 22 (95%) MCN и е увеличен в 12 (55%). При резекция повечето MCN са имали нискостепенна дисплазия (16 от 22,73%), докато останалите са имали умерена степен на дисплазия (n = 6,29%). Общо 3 от 22 (14%) MCNs съдържат мутацията KRAS (Фигура 2). Въпреки това не са наблюдавани значителни разлики в демографските данни на пациентите, ендоскопските ехографски находки, адекватността на пробата, анализа на кистозна течност, средната концентрация на ДНК или хистологичните характеристики в сравнение с MCN от типа KRAS. .
KRAS- мутантна муцинозна кистозна неоплазма (MCN). ( а Анехогенна и дистално укрепваща киста е идентифицирана в тялото/опашката на панкреаса чрез ендоскопски ултразвук. Кистата измерва 6.5 cm в максимален напречен диаметър. Бяха идентифицирани няколко тънки отделения. Установено е, че течността, получена чрез аспирация с фина игла, е бистра и тънка. ( б ) Цитологичните цитонамазки са по-малко от оптимални, но пробата от цитоспин показва умерен брой хистиоцити във фона на муцин, съответстващ на съдържанието на киста. ( ° С, д ) Дистална проба на панкреатектомия демонстрира мултилокулирана киста с муцинозна епителна лигавица. Ядрата бяха еднородни и основно ориентирани. Под лигавицата на кистата плътният стромар от яйчников тип съответства на MCN.
Изображение в пълен размер
Корелация на KRAS статуса и други ендоскопски ултразвукови находки за фина аспирация с хирургично резецирани IPMN и MCN
Като цяло, KRAS мутациите имат специфичност от 100% за муцинозна диференциация при хирургично резецирани кисти на панкреаса, но само с чувствителност от 54%. За сравнение, увеличеният вискозитет на течността и увеличеният CEA имат по-ниска специфичност (69% и 85%), но по-висока чувствителност (68% и 62%). Цитопатологичната диагноза на поне заподозрени за неопластична муцинозна киста има сходна специфичност от 73%, но значително по-ниска чувствителност от 39%. За IPMN наличието на множество кисти има специфичност от 59% и чувствителност от 80%. Комбинацията от точкови мутации на KRAS и повишена CEA подобри чувствителността на двата анализа до 83% и поддържа висока специфичност от 85% за муцинозна диференциация. Добавянето на вискозитет на течността към KRAS и CEA повишава чувствителността (90%), но със загуба на специфичност (64%). Мултимодалният подход, използващ KRAS, CEA, вискозитет на течността и цитология, допълнително повишава чувствителността до 91%, но намалява специфичността до 56%.
Когато се стратифицира по тип киста, KRAS има специфичност и чувствителност от 95% и 67% за IPMNs срещу 58% и 14% за MCN. Въпреки че IPMN често са мултифокални, обикновено имат повишен CEA и често показват повишен вискозитет на течността, специфичността на всеки параметър е по-ниска (86%, 69% и 66%) в сравнение с KRAS. В допълнение, чувствителността беше или подобна, или малко по-ниска (48%, 68% и 63%). За MCN повишената CEA има по-висока специфичност (71% срещу 58%) и чувствителност (55% срещу 14%) от KRAS. За разлика от това, повишеният вискозитет на течността има по-ниска специфичност от 48%, но по-висока чувствителност от 55%. Всички MCN в това проучване са самотни.
дискусия
Проучването PANDA е най-големият мултицентров тест до момента за оценка на молекулярния анализ на кистозна течност на панкреаса при диагностицирането на муцинозни кисти. Той включва 113 пациенти с кисти на панкреаса, които са претърпели хирургична резекция или са имали диагностична цитологична аспирация. ДНК на кистозна течност е получена чрез ендоскопска ултразвукова аспирация с фина игла и е анализирана в търговска лаборатория, Redpath Integrated Pathology (Pittsburgh, PA, USA). Молекулярният анализ включва количествено определяне на ДНК, тестване на кодон KRAS 12 и анализ на алелни загуби на широк панел от микросателитни маркери, включително секвениране. Мутациите в KRAS кодон 12 показват най-високо съотношение на шансовете (20, 9) и специфичност (96%), но ниска чувствителност (45%) към муцинозна диференциация. За сравнение, увеличеният CEA има специфичност и чувствителност съответно 83% и 64%. Анализът на KRAS мутация увеличи чувствителността на анализа на CEA от 64% на 82%, като същевременно запази специфичността до 83%.
В опит да се справим с проблемите, произтичащи от проучването PANDA, ние интегрирахме KRAS теста като част от рутинната оценка на панкреатични кистозни новообразувания като част от нашия голям обем на услугата за киста на панкреаса. Преобладаването на мутациите на KRAS кисти е било 38% за 6 години. В допълнение към KRAS мутациите, локализирани в кодон 12, ние също така открихме мутации в кодони 13 и 61. Въпреки че корелационното хистологично наблюдение е налице само при 25% от пациентите, общо 73 IPMN и 21 MCN са резецирани. В допълнение, повечето от тези муцинозни кисти (67%) показват нискостепенна дисплазия. Подобно на резултатите от проучването PANDA, KRAS мутациите имат висока специфичност (100%), но ниска чувствителност (54%) към муцинозни кисти. Анализът на CEA има специфичност от 85% и чувствителност от 62%. В комбинация и двата теста повишават чувствителността до 83%, като същевременно запазват висока специфичност от 85%. Възпроизводимостта на резултатите от проучването PANDA по отношение на KRAS потвърждава неговата полезност при идентифициране на муцинозни кисти. Заедно с анализа на CEA, тестването на KRAS може да подобри диагностичния добив на аспирати с фина игла на кистата на панкреаса.
Струва си да се отбележи, че в нашето изследване все още има пристрастия в селекцията. По-конкретно, изследването на KRAS беше проведено по преценка на ендоскопа. Следователно, кистозните течности от псевдокисти при пациенти с анамнеза за коремна травма или директни IPMN основни канали чрез образно изследване са пропуснати от KRAS анализа. Може обаче да се твърди, че в тези настройки не се изисква тестване на молекулярни помощници. Забележително е, че предишни проучвания показват, че класификацията на кистозна течност въз основа на KRAS мутации може да доведе до фалшиво положителни резултати. Panarelli et al. 15 идентифицираха две псевдокисти с KRAS мутации, използвайки същия търговски панел за биомаркери (PathfinderTG) като проучването PANDA. Следователно е необходимо резултатите от KRAS да се интерпретират като част от мултидисциплинарен подход.
Соматичните мутации в KRAS са често срещани както в IPMN, така и в MCNs, с докладвана честота, варираща от 30% при нискостепенни лезии до 80% при високостепенни лезии. 18, 19, 20, 21, 22 В съответствие с предишни проучвания, разпространението на KRAS мутации в IPMN е 67%. За разлика от това, само 14% от MCN съдържат мутацията KRAS. Тези открития може да се дължат на липса на чувствителност в нашата техника за откриване на ДНК. Въпреки това, мутациите на KRAS в IPMN са идентифицирани последователно със сравнима скорост като проучвания, използващи хирургичен резекционен материал или следоперативна кистозна течност. Като алтернатива, количеството ДНК от лизирания и освободен епител, получено чрез аспирация с фина игла, може да бъде по-малко от количеството, открито при постоперативна аспирация поради хирургическа манипулация. Или само 14% от MCN в нашата проучвана група всъщност имат KRAS мутации. Каквато и да е причината, са необходими допълнителни маркери за подобряване на чувствителността на ДНК анализа на кистозна течност.
Важен аспект, който не е разгледан в това проучване, е способността на ДНК анализа да различава произвеждащи муцин лезии с нискостепенна дисплазия (доброкачествена) от тези с високостепенна дисплазия или асоцииран инвазивен рак (злокачествено заболяване). KRAS мутациите сами по себе си не корелират с по-висока степен при новообразувания, произвеждащи муцин. Проучването PANDA съобщава, че анализът на множествена алелна загуба> 82% или комбинация от KRAS мутация и анализ на висока алелна загуба са силно предсказващи за злокачествено заболяване. Тези открития бяха потвърдени от Shen et al., 14, които анализираха 35 проби от течности на панкреатична киста, използвайки Redpath's PathfinderTG. Авторите откриват 89% съгласие между молекулярните и клиничните консенсусни диагнози, включително 83% за злокачествени, 87% за доброкачествени муцинозни и 93% за доброкачествени не захарни кисти. За разлика от това, изследването на Panarelli et al. 15 и Toll et al. 16 отчитат степен на съответствие от 39% и 56%. Широката вариабилност в съгласието между молекулярната и клиничната диагноза може да се обясни с липсата на данни за хирургично проследяване в последните две проучвания. Въпреки това, както при KRAS анализа, са необходими бъдещи проучвания, включващи по-дълъг период на наблюдение и корелирано хирургично проследяване.
В обобщение представяме най-голямата поредица от KRAS анализ на ендоскопска ултразвукова аспирация с фина игла, получена от кистозна течност на панкреаса. В комбинация с клинични и рентгенографски находки KRAS е силно специфичен, но има слаба чувствителност към муцинозна диференциация. Добавянето на CEA анализ подобри чувствителността на KRAS анализа, като същевременно запази висока специфичност. Когато се разслоява от тип муцинозна киста, KRAS тестването има лека чувствителност към IPMN, но не е достатъчно за идентифициране на MCN. Необходими са бъдещи молекулярни изследвания, които да включват допълнителни гени и други течни маркери, за да се подобри откриването и класификацията на лигавицата на панкреаса с помощта на ендоскопска ултразвукова фина игла.