елементи
абстрактно
Целта на това проучване е да се определи връзката доза-отговор за смъртност и деформация в ранните етапи от живота на рибките след риболов след микроинжектиране на SeMet градуирани дозови ембриони и да се изследва потенциалният основен механизъм (механизми) на Se-индуцирана токсичност за развитие. Има много ползи от използването на риба зебра за токсикологията на развитието и проучванията за манипулация на ембриони. Zebrafish произвеждат прозрачни и незалепващи ембриони, които помагат за успешното микроинжектиране на химикали 26, 27, 28. Като се има предвид обширната информация за биологията на развитието и генома на зебрата, токсикологичните изследвания за развитието могат лесно да бъдат извършени върху този вид риби 27, 28 .
резултатът
Концентрации на селен
Измерените и номиналните концентрации на Se бяха пряко пропорционални на всяка лекувана група. Измерените концентрации на Se в контролните, 8, 16 или 32 ug Se/g сухо тегло (dm) микроинжектирани групи са 1,6 ± 0, 1, 11, 0 ± 0, 6, 18, 7 ± 1, 0 и 29,3. 0,5 ug Se/g dm, съответно. Значително по-високи концентрации на Se се наблюдават в микроинжектирани яйца с 8, 16 или 32 ug Se/g dm в сравнение с яйца, микроинжектирани с безсерумен разтвор на Danieau (контрола) (p
* Значителна разлика в сравнение с контролната група, използваща еднопосочен ANOVA, последван от теста на Dunnett (стр
* Значителна разлика в сравнение с контролната група, използваща еднопосочен ANOVA, последван от теста на Dunnett (стр
Снимка A показва нормална (контролна) риба, Б. показва кифоза и лордоза, ° С показва оток, д показва сколиоза, Е. показва деформации на перките и F е личиночна риба с множество деформации и перикарден оток.
Изображение в пълен размер
Ефекти от излагане на антиоксидантни реакции
Излишните транскрипти nrf2a и nrf2b, глутатион пероксидаза 1a (gpx1a), глутатион S-трансфераза pi 1 и 2 (gstp1 и gstp2), арил въглеводороден рецептор 2 (ahr2) и протеин тирозин фосфатаза 1b (ptp1b) бяха определени при 48, ptp1b). часове след оплождането (hpf) в ларви на данио от контролни и 10 ug микроинжекционни групи Se/g dm. Повишаване на регулацията на nrf2a и nrf2b се наблюдава при 72 и 96 hpf при зебра от групата, изложена на SeMet, в сравнение с контролната група (фиг. 4А, В). Значително по-голямо регулиране на излишъка на nrf2a транскрипт се наблюдава при 96 hpf, докато броят на nrf2b транскриптите е значително увеличен както при 72, така и при 96 hpf (p
Превишение на фактор 2a (nrf2a), ( Б. ) nrf2b, ( ° С ) глутатион S-трансфераза pi1 (gstp1), ( д ) gstp2, ( Е. ) арил въглеводороден рецептор 2 (ahr2), ( Б. ) nrf2b, ( ° С ) gstp2, ( Е. ) арил въглеводороден рецептор 2 (ahr2)) и ( F ) протеинова тирозин фосфатаза 1B (ptp1b) в риба зебра, изложена на 10 μg Se/g dm под формата на селенометионин или контролен разтвор (Danieau) чрез микроинжектиране на ембриона. Излишъкът от транскрипт се определя чрез количествена PCR в реално време 48, 72 и 96 часа след оплождането (hpf). * Значително различен от контролната група, използвайки студентския t-тест (стр
Превишен препис ( A ) метионин аденозилтрансфераза 1а (мат1а); а ( Б. ) mat2ab при рибки зебра, изложени на 10 μg Se/g dm под формата на селенометионин или контролен разтвор (Danieau) чрез микроинжектиране на ембрион. Излишъкът от транскрипт се определя чрез количествена PCR в реално време 48, 72 и 96 часа след оплождането (hpf). * Значително различен от контролната група, използвайки студентския t-тест (p 2, 3, 29). В това проучване се наблюдава значително намаляване на люпилнята на ембриони, дозозависимо увеличаване на смъртността и деформациите и променени изобилия от транскрипти nrf2a nrf2b, gstp2, ahr2, ptp1b, mat1a и mat2ab, в ранните етапи от живота.имаха значение за околната среда в това проучване и такива концентрации бяха регистрирани в рибни яйца, събрани от водни екосистеми, замърсени със Se. 11, 29, 29, 30 .
Съществува баланс между дейностите на протеиновите тирозин кинази (PTKs) и протеиновите тирозин фосфатази (PTPs) в клетките, които играят ключова роля в клетъчната сигнализация и развитието на животните 42, 43, 44. Доказано е, че оксидативният стрес и излагането на химикали, включително SeMet, инхибират изобилието на транскрипти и/или активността на протеин тирозин фосфатаза 1B in vitro и in vivo 25, 42, 45, 46. Предишни проучвания демонстрират ролята на ptp1b в адхезията на клетъчните клетки, ангиогенезата, апоптозата и клетъчната миграция 43, 47, 48, критичните процеси в развитието на гръбначните ембриони. Следователно, ние изследвахме броя на транскриптите на ptp1b в ранните етапи от живота на зебра след излагане на развитие на излишък от SeMet чрез микроинжектиране на яйца и установихме, че SeMet причинява значително регулирано изобилие на транскрипта на ptp1b при 48 hpf. Това откритие предполага, че модифицирането на активността на протеиновата тирозин фосфатаза може също да бъде свързано с индуцирана от серума токсичност за развитие при риба зебра.
В заключение, резултатите ни показват, че съхраняването на по-високи концентрации на свободна форма на SeMet в яйцата за предпочитане причинява смъртност, а не деформация в ранните етапи от живота на рибите. Излагане на развитие на излишък от SeMet чрез ембрионално микроинжекционно изменение на генната експресия на реагиращи на оксидант транскрипционни фактори, nrf2a и nrf2b, както и gstp1, gstp2, ptplb, ahr2, matla и mat2ab. Тези резултати показват, че токсичността за развитие при излишък на изложени на SeMet риба зебра може да се дължи на оксидативен стрес или нарушено метилиране или комбинация от тези механизми. И накрая, нашето проучване показва, че техниките за микроинжектиране на ембриони могат успешно да се използват за изследване на механизмите на токсичност на тератогенните химикали в ранните етапи от живота на зебра.
методи
Тестово съединение
Селено-L-метионинът е закупен от Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Канада). Чистотата на съединението е по-голяма от 98%.
Тестово животно
Всички процедури за отглеждане на риби и експериментални процедури, приети в това проучване, са одобрени от Етичния съвет за изследване на животните към Университета в Саскачеван (Протокол № 20030076) и са спазени насоките на Канадския съвет за грижа за животните за хуманна употреба при животните . Възрастен див тип риба зебра (щам AB; на възраст около 4-5 месеца) е закупен от местен доставчик и е поставен в контролирана от околната среда температурна камера (28,0 ± 1,0 ° C) и фотопериод (светлина за 14 часа и 10 часа тъмно ).). Средното мокро телесно тегло на рибата е 0,366 ± 0,019 g. Възрастните риби се аклиматизират в лабораторни условия 4 седмици преди размножаването. По време на периода на аклиматизация, рибите са хранени с основен фуражен фураж Nutrafin® (Hagen Inc., Montreal, QC, Канада) и пречистени хироми (Bio-Pure Blood Worms, Hikari Sales Inc., Hayward, CA, USA).
микроинжекции
Освен това е причинена концентрацията на яйце Se, причиняваща 20% смъртност (
10 μg Se/g dm) и тази доза се инжектира в жълтъка, за да се определи количеството на чувствителни към окислители генни иРНК (nrf2a, nrf2b, gpx1a, gstp1 и gstp2). ), ензими, участващи в катаболизма на метионин (mat1a, mat2a, mat2aa и mat2ab), ahr2 и ptp1b при 48, 72 и 96 hpf зебра.
Деформационен анализ
Анализът на общия щам беше извършен върху 6 dpf ларви на зебра. Подробната процедура за анализ на деформацията е обяснена по-рано. Накратко, ларвите на зебра са евтаназирани чрез предозиране на буфериран трикаин метансулфонат (MS-222) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада) и консервирани в 10% буфериран формалин в продължение на 12 часа, преди да бъдат прехвърлени в 70% етанол. Всяка ларва на ларвите беше изследвана за скелетна, черепно-лицева и деформация на ребрата и оток с помощта на модел на дисекционен микроскоп на Olympus SZ-CTV (Olympus, Melville, NY, USA) и за всяка риба беше регистрирано наличие или отсъствие на аномалии в развитието. Общият процент на деформации се изчислява, като броят на деформираните ларвени риби се дели на общия брой ларвени риби и се умножава по 100.
Количествено определяне на селен
Общите концентрации на Se в събрани проби от яйца бяха измерени чрез индуктивно свързана плазмена масова спектрометрия (ICP-MS) в Токсикологичния център (Университет в Саскачеван, Саскатун, SK, Канада). От всяка обработена група се събират п = 3 до 4 повторения от 45 до 50 обединени яйца за количествено определяне на Se. Подробна процедура за анализ на Se е описана по-рано 3, 59. Границата на количествено определяне (LOQ) от 0,13 μg Se/g беше определена, като се използват заготовки на метода. Концентрациите на Se в яйцата се измерват на мокра основа и се превръщат в сухо тегло въз основа на съдържание на влага 92,5%, определено в подгрупа от зебра яйца.
Верижна реакция в реално време (Q-PCR)
Експресията на MRNA за гени, кодиращи ензими или транскрипционни фактори, представляващи интерес, се определя количествено, като се използва количествена полимеразна верижна реакция (Q-PCR). Общата РНК се извлича от n = 3-5 повторения на 20 ембриони и/или ларви на риба зебра от всяка третираща група, като се използва RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Канада), съгласно инструкциите на производителя. Пречистената обща РНК се определя количествено, като се използва спектрофотометър NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Комплектът за обратна транскрипция QuantiTect® (Qiagen) се използва за синтезиране на cDNA от 1 μg обща РНК. Подробни процедури за екстракция на РНК и синтез на кДНК са обяснени другаде 25 .
Количествената PCR в реално време се извършва в PCR плаки с 96 ямки, използвайки ABI 7300 PCR система в реално време (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ген-специфичните праймери са проектирани срещу целеви гени, като се използва софтуер Primer 3 и са показани последователности на праймери (Таблица 2). Подробни процедури за Q-PCR са обяснени другаде 25. Появата на целевия ген на транскрипта е количествено определена чрез нормализиране до експресията на фактор на удължаване 1а (ef1α) съгласно метода MNE (средно нормализирано средно изражение) съгласно Simon (2003) 60 .
Маса в пълен размер
Статистически анализ
Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на Sigmaplot 11 (Systat Software Inc., Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Данните бяха тествани за нормалност с помощта на теста на Шапиро-Уилк и за хомогенност на разсейването с помощта на теста на Левен. Данните, които не отговарят на изискванията за параметрични статистически процедури, бяха трансформирани в дневник 10. Нетрансформираните данни са показани на всички фигури. Значителни разлики в общите концентрации на Se в яйцата, люпилнята на ембриони и смъртността и общите ранни деформации на зебра от контролни и степенувани микроинжекционни групи SeMet бяха тествани чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Dunnett. Излишните транскрипти на гени за антиоксиданти, метилиране, AhR и протеинова фосфатаза, свързани с активността на рибката на данио от контролната група и 10 μg групи, инжектирани със Se/g dm при 48, 72 и 96 hpf, бяха тествани с помощта на студентски t-тест. Данните бяха изразени като средно ± SEM Разликите се считаха за статистически значими при p