елементи
абстрактно
Нарушената чернодробна абсорбция на глюкоза (HGU) причинява постпрандиална хипергликемия при диабет тип 2. Тук показахме, че намалената чернодробна активност на Sirt2 влошава HGU при затлъстели мишки с диабет. Свръхекспресията на Hepat Sirt2 увеличава HGU при затлъстели мишки с високо съдържание на мазнини (HFD) и облекчава техния нарушен глюкозен толеранс. Намалената чернодробна Sirt2 при недиабетни мишки намалява HGU и причинява нарушен глюкозен толеранс. Sirt2 насърчава глюкозозависимия HGU чрез деацетилиране на регулаторната протеинова глюкокиназа K126 (GKRP). Глюкокиназната и GKRP глюкозо-зависимата дисоциация е от съществено значение за HGU, но се инхибира в хепатоцити, получени от затлъстели диабетни мишки, изчерпани от Sirt2 или трансфектирани с мутанти, имитиращи ацетилиране на GKRP. Мутантите, имитиращи дезацетилиране на GKRP, се дисоциират от глюкокиназа по глюкозо-зависим начин при затлъстели диабетни хепатоцити, получени от мишки и повишават толерантността към HGU и глюкозата при индуцирани от HFD или db/db затлъстели диабетни мишки. Ние показахме, че Sirt2-зависимото деацетилиране на GKRP подобрява нарушената HGU и предполагаме, че това може да е терапевтична цел за диабет тип 2.
Постпрандиалната хипергликемия е тясно свързана с повишен риск от сърдечно-съдови усложнения и леталност при диабет тип 2 1, 2, 3. Поглъщането на чернодробна глюкоза (HGU) представлява една трета от приема на екзогенен глюкоза с храната 4, а нарушеното HGU при затлъстяване и диабет тип 2 причинява постпрандиална хипергликемия 5, 6. Съобщава се, че неправилното активиране на чернодробната глюкокиназа е отговорно за увреждането на HGU при диабет тип 2, 5, 7, но точният механизъм на HGU и активирането на увреждане на глюкокиназата остава да бъде изяснен.
Глюкокиназата играе важна роля в HGU 8 след хранене. Глюкокиназата катализира фосфорилирането на глюкозата до глюкозо-6-фосфат, докато обратната реакция се катализира от глюконеогенния ензим глюкозо-6-фосфатаза (G6Pase). HGU се основава на баланс между глюкокиназа и G6Pase 9, но чернодробната активност на G6Pase не се променя значително до 90 минути след хранене. Острото повишаване на чернодробната глюкокиназна активност в отговор на повишаване на нивата на глюкоза в кръвта след хранене се дължи главно на пост-транслационен механизъм, зависим от регулаторната протеинова глюкокиназа (GKRP) 8. GKRP инхибира глюкокиназната активност чрез свързване с ензим и глюкозата дисоциира GKRP от глюкокиназата, като по този начин активира глюкокиназата 8, 11. Малкомолекулни глюкокиназа-GKRP, които насърчават дисоциацията на свързването на глюкокиназа-GKRP, понижават нивата на кръвната глюкоза при затлъстели мишки с диабет 12, което показва значението на GKRP за поддържане на хомеостазата на кръвната глюкоза. Ролята на GKRP в увреждането на HGU при диабет тип 2 обаче остава неясна.
Установихме, че изчерпването на NAD + е свързано с увреждане на HGU при затлъстели мишки с диабет и че Sirt2 играе важна роля в този процес чрез деацетилиране на GKRP. В допълнение, ограниченото деацетилиране на GKRP, зависимо от Sirt2, намалява толерантността към HGU и глюкозата и свръхекспресията на Sirt2 или мутацията на GKRP, което имитира мимоцетилиране, подобрено увреждане на HGU и подобрен глюкозен толеранс при затлъстели мишки с диабет.
резултатът
Възстановяването на NAD + увеличава HGU при затлъстели мишки с диабет
Нокдаунът Sirt2 предотвратява NAD + зависим HGU
Деацетилирането на GKRP улеснява дисоциацията на глюкокиназа-GKRP
Деацетилирането на K126 върху GKRP играе съществена роля в NAD +/Sirt2-зависимото усвояване на глюкоза. а - ° С Ефект на медиирана от аденовирус чернодробна свръхекспресия на GKRP-K126R или див тип GKRP-GT (GKRP-WT) при мишки с нокдаун на Sick2 върху нивата на кръвната захар (n = 5) ( а ), плазмен инсулин (n = 5) 5) ( б ) и прием на 2-дезоксиглюкоза (2-DG) в черния дроб, WAT и скелетните мускули (n = 4) ( ° С ) след приложение на глюкоза (2 g/kg). д - е Ефект на медиирана от аденовирус чернодробна свръхекспресия на GKRP-K126Q или GKRP-WT при мишки с високо съдържание на мазнини (HFD), третирани с NMN, върху нивата на кръвната глюкоза (n = 5) ( д ), плазмен инсулин (n = 5) ( д ) и поглъщане на 2-DG в черния дроб, WAT и скелетните мускули (n = 4) ( е ) по време на приложение на глюкоза (1 g/kg). * Р
Тъй като HGU се регулира както от глюкоза, така и от инсулин 4, независимият от инсулин ефект на глюкозен толеранс на NAD +/Sirt2 може да бъде отчасти отговорен за глюкозозависимата регулация на HGU, което включва също глюкокиназа и GKRP. В проучвания, използващи ко-имунопреципитация и hAG/пепелни маркери, GKRP е проектиран като директен целеви протеин за Sirt2. След това установихме, че нокдаунът на Sirt2 и свръхекспресията водят до повишено и намалено ацетилиране на GKRP в първичните хепатоцити, което предполага, че Sirt2 деацетилира GKRP. Експресията на чернодробни Gck гени се увеличава след нокдаун на черния дроб на Sirt2 и намалява след свръхекспресия на Sirt2 в черния дроб. Тези промени могат да доведат до подценяване на ефектите от Sirt2 върху регулирането на HGU. Тъй като нокдаунът Sirt2 няма ефект върху експресията на Gck гена в първичните хепатоцити, тези промени в експресията на Gck гена при условия на нокдаун и свръхекспресията на Sirt2 може да се дължат на промяна в нивата на инсулин в плазмата, които корелират с инсулиновата чувствителност.
Мас спектрометрия и мутантни GKRP изследвания показват, че K126 GKRP е целевото място за деацетилиране на Sirt2. GKRP ацетилирането е напреднало в черния дроб на HFD-хранени мишки, докато GKRP ацетилирането се отслабва в db/db миши хепатоцити и черен дроб, свръхекспресиращ черния дроб K126R. Това предполага, че K126 претърпява повишено ацетилиране след намалена активност на Sirt2 в затлъстели диабетни черни дробове. GKRP ацетилирането все още показва малка промяна след прилагане на глюкоза и минимално увеличение след реваксинация при слаби мишки, но нокдаунът Sirt2 доведе до повишено ацетилиране на GKRP при слаби мишки. Тези открития показват, че активността на Sirt2 е достатъчна за деацетилиране на GKRP в черния дроб на слаби мишки, дори при условия на гладно и хранене. Ацетилирането на GKRP включва не само деацетилаза, но и ацетилтрансфераза. Подробният механизъм, легнал в основата на лека промяна в ацетилирането на GKRP след реваксинация, е неясен, но може да включва ацетилтрансфераза. Проучване върху HeLa клетки идентифицира p300 като ацетилтрансфераза, отговорна за ацетилирането на K5 на GKRP 24, но е необходимо допълнително проучване, за да се установи механизмът на ацетилиране на K126, открит в нашето проучване.
Проучванията in vivo показват, че деацетилирането на GKRP K126, зависимо от Sirt2, играе важна роля в патогенезата на HGU и нарушенията на толерантността към глюкозата при затлъстелите диабетни черни дробове. Тъй като мутацията на GKRP (K126Q), имитираща ацетилиране, инхибира глюкозозависимата глюкокиназа - GKRP дисоциация и намалява поглъщането на 2-DG в хепатоцити, получени от мишки, мишки, експресиращи чернодробно ацетилиране GKRP (K126Q), показват намален хепатичен 2-DG прием нарушен глюкозен толеранс и устойчивост на NMN-зависимо подобрение на затрудненото чернодробно поемане на 2-DG и непоносимост към глюкоза при затлъстели мишки, хранени с HFD. От друга страна, тъй като дисоциацията на глюкозозависимата глюкокиназа - GKRP беше възстановена и поглъщането на 2-DG беше увеличено чрез свръхекспресия на имитиращ деацетилиране GKRP мутант (K126R) в db/db хепатоцити, получени от мишка, трансмисия на деацетилиране, имитираща GKRP (K126R) в черния дроб на HFD-хранени мишки и db/db мишки повишено чернодробно поемане на 2-DG и подобрен глюкозен толеранс и инсулинова резистентност, въпреки че техните чернодробни нива NAD + не са засегнати. Освен това, чернодробната трансдукция на K126R преодоля чернодробната Sirt2, предизвикана от нокдаун, нарушено чернодробно поемане на 2-DG и непоносимост към глюкоза.
Това проучване разкри, че NAD +/Sirt2 са важни за регулирането на HGU и че Sirt2 позволява зависима от глюкозата дисоциация на глюкокиназата от GKRP чрез деацетилиране на K126 на GKRP. При HFD-хранени затлъстели мишки с диабет и db/db мишки, активността на Sirt2 намалява с намаляването на съдържанието на NAD + в черния дроб, което засилва ацетилирането на GKRP и уврежда HGU. Освен това установихме, че K126 деацетилирането на GKRP облекчава нарушения глюкозен толеранс и инсулиновата резистентност при затлъстели диабетни HFD-хранени мишки и db/db мишки. Тези открития предполагат, че NAD +/Sirt2-зависимата регулация на деацетилирането на GKRP играе важна роля в контрола на HGU и че тази регулация е нова терапевтична цел при диабет тип 2 и затлъстяване и е отговорна за увреждането на HGU.
методи
Клетъчна култура
Биохимичен анализ
Нивата на NAD + и 2-DG в първични хепатоцити и тъканни проби бяха измерени, като се използва NAD/NADH набор за количествено определяне (BioVision, Mountain View, CA) и 2-DG комплект за измерване на поглъщането (Cosmo Bio, Токио, Япония), съответно.
Изпитване на толерантност към глюкоза
За интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза, на мишките се прилага интраперитонеално 1 g/kg телесно тегло глюкоза за HFD-хранени мишки и 2 g/kg телесно тегло глюкоза за NC-хранени мишки, със или без продължително интравенозно приложение на соматостатин (3 μg/kg/мин) (Sigma) през яремния катетър от 1 h преди приложение на глюкоза. Нивата на кръвната глюкоза се измерват с помощта на измервателен уред GLUCOCARD G + (Arkray, Киото, Япония) и търговски колориметричен комплект (Wako). Плазмените нива на инсулин са измерени с помощта на комплект за миши инсулин ELISA (Shibayagi, Gunma, Япония).
Хиперинсулинемично-хипергликемично затягане
Проучванията на хиперинсулинемично-хипергликемична скоба се провеждат 4–7 дни след канализиране, както е описано по-рано с модификации 28. Хиперинсулинемично-хипергликемично притискане се извършва при будни и необуздани през нощта гладуващи мишки. По време на проучването на скобата инсулин (1,25 mU/kg/min) (Eli Lilly, Indianapolis, IN) и соматостатин (3 μg/kg/min) се вливат през югуларния катетър с променливо количество 40% разтвор на глюкоза, за да се поддържа ниво на глюкоза в кръвта при 280 ± 30 mg/dl. След 50 минути 2-DG (200 μmol/kg) се прилага интравенозно в продължение на 1 минута и 10 минути след 2-DG приложение се вземат проби от черен дроб, WAT и мускули на солеус за 2-DG анализ.
Количествена PCR
Количествена PCR се извършва, както е описано по-горе 29. Общата РНК се извлича от замразени тъканни или клетъчни проби, използвайки SV Total RNA Isolation System (Promega). cDNA е синтезирана от обща РНК с комплекта реактив PrimeScript RT (Takara Bio, Otsu, Япония). Количествената PCR беше извършена чрез използване на SYBR Select Master Mix комплект (Life Technologies) с 36B4 като контролен ген. Последователностите на праймерите, използвани в това проучване, са достъпни при поискване (36B4, Gck [който кодира глюкокиназа] и G6pc [който кодира G6Pase]).
Western blot и имунопреципитация
Уестърн блот се извършва, както е описано по-горе. Чернодробните тъкани и култивираните клетки се хомогенизират в ледено студен CelLytic MT клетъчен лизисен реагент (Sigma) с протеазни инхибитори. Имунопреципитацията се извършва, като се използват ацетилирани К антитела, конюгирани с Dynabeads Protein G (Life Technologies) или Flag tag антитяло, конюгирани магнитни топчета. Антителата, използвани при имунопреципитацията на Flag tag, ацетилиран K на GKRP и ацетилиран K на кератин 8, са магнитни мъниста с анти-DYKDDDDK тагове (1E6, 10 μl/mg протеин; Wako), анти-AcK (# 9441, 0.2 μl/mg протеин; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) и anti-AcK (ab21623, 0,2 μl/mg протеин; Abcam, Cambridge, UK), съответно. Следните антитела са получени за имуноблотинг: anti-Sirt2 (sc-20966, 1: 500), анти-глюкокиназа (sc-7908, 1: 500), анти-GKRP (sc-11416, 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology ), анти-Sirt1 (07-131, 1: 1000; Millipore, Billerica, MA), анти-флаг (F1804, 1: 1000), анти-β-актин (A5441, 1: 1000) (Sigma), анти- HA (3F10, 1: 1000; Roche), анти-Halo (G9281, 1: 1000; Promega) и анти-кератин 8 (TROMA-I, 1: 200; Развитие на изследванията Hybridoma Bank, Iowa City, IA). Имуноблот изображенията са количествено определени чрез денситометрия на LAS-3000 Imager (Fujifilm, Токио, Япония). Неизрязаните изображения на представителни имуноблоти са показани на допълнителна фиг. 9.
Аденовирусни вектори
Аденовирусни вектори (маркирани със флаг Sirt2, маркирани с HA Sirt2, маркирани с флаг глюкокиназа, маркирани с HA глюкокиназа, глюкокиназа, маркирани с флаг GKRP, маркирани с флаг K126R GKRP, маркирани с флаг K126Q GKRP и U6) са конструирани от Adenovirus Комплект за двоен израз (Takara Bio). Аденовирусен вектор, кодиращ маркиран със флаг Sirt1, е предоставен от T Kitamura (Gunma University). Изолирани миши хепатоцити и мишки бяха използвани за всеки експеримент съответно 24 часа и 3-4 дни след трансфекция на аденовирус. Мишките получиха аденовируси (5,0 × 10 8 образуващи плака единици) във вената на опашката.
Анализ на протеин - протеиново взаимодействие
Взаимодействието между Sirt2 и GKRP или глюкокиназата се анализира чрез флуоресцентна система за откриване на протеиново-протеинови взаимодействия (MBL, Нагоя, Япония), която открива протеиново-протеиновите взаимодействия като флуоресцентни огнища. Хепатоцитите бяха трансфектирани с phAG-маркирани Sirt2, GKRP или глюкокиназа и pAsh-маркирани Sirt2, GKRP или глюкокиназни вектори, като се използва Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). Вътреклетъчните флуоресцентни огнища бяха наблюдавани с помощта на флуоресцентен микроскоп (FSX100; Olympus, Токио, Япония).
Масспектрометричен анализ на GKRP
Целоклетъчните лизати на HEK293 клетки, трансфектирани с маркиран с флаг GKRP, бяха имунопреципитирани от анти-DYKDDDDK антитяло (Wako). Слития протеин се елуира с DYKDDDDK пептид (Wako) и се имунопреципитира отново чрез анти-АСК (клетъчна сигнална технология). Имунопреципитатът се разтваря на 4-12% градиент SDS-PAGE гел и протеиновата лента се подлага на мас спектрометричен анализ от MS Bioworks (Ann Arbor, MI). За масспектрометричен анализ на съединенията в тази статия вижте допълнителна фигура 5.
Статистически анализ
Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Не са използвани статистически методи за определяне на размера на извадката преди експеримента, който вместо това се основава на предварителни данни и предишни публикации. Животните бяха изключени от експерименти, ако показваха някакви признаци на заболяване. Дисперсионната хомогенност беше изследвана с помощта на теста на Levene за множество групи или F-тест за две групи. Статистическият анализ беше извършен с помощта на t-критерия на Student за сравнение на две групи и еднопосочен ANOVA с PLSD на Fisher post-hoc тест за сравнение на няколко групи. Разликите се считат за значими при P