- елементи
- абстрактно
- Въведение
- Материали и методи
- резултатът
- Доклад за случая
- Общото секвениране на exom идентифицира варианти в NDUFAF4
- Вариантът NDUFAF4 води до изолиран дефицит на CI, който може да бъде спасен чрез лентивирусна комплементация с див тип NDUFAF4.
- Дефицитът на CI във фибробластите с дефицит на NDUFAF4 причинява променена суперкомплексна стехиометрия
- Дефицитът на NDUFAF4 води до натрупване на междинни съединения на CI, съдържащи компоненти на проксимален P-модул, дистален P-модул и N-модул
- дискусия
- Допълнителна информация
- Word документи
- Допълнителна информация
- Файлове с изображения
- Допълнителна фигура 1
- Допълнителна фигура 2
- Допълнителна фигура 3
елементи
- Генетика на болестите
- Метаболитни нарушения
абстрактно
Комплексът на митохондриалната дихателна верига I се състои от 44 различни субединици и може да бъде разделен на три функционални модула: Q-, P- и N-модул. NDUFAF4 (C6ORF66) е сложен I монтажен фактор, който е свързан с междинните съединения на Q-модула. Чрез секвениране на екзоми ние идентифицирахме хомозиготен вариант на мисенс при сложен I-дефицитен пациент със синдром на Leigh. Суперкомплексният анализ на фибробластите на пациента разкрива специфично променена стехиометрия. Подробен анализ на сглобяването на комплекс I, посочващ всички негови сглобяеми пътища, показва натрупването на части от P- и N-модула, но не и Q-модула. Лентивирусна комплементация на пациентски фибробласти с див тип NDUFAF4 спаси дефицит на комплекс I и разстройство на сглобяването, потвърждавайки причинната роля на варианта. Нашият доклад за второто семейство, засегнато от варианта NDUFAF4, допълнително характеризира фенотипния спектър и хвърля светлина върху ролята на NDUFAF4 в биогенезата на митохондриалния комплекс I.
Митохондриалната дихателна верига I (CI, NADH: убихинон оксидоредуктаза) е най-големият компонент на системата за окислително фосфорилиране (OXPHOS). Той е L-образен и може да бъде разделен на три функционални модула: Q-модул (редукция на убихинон) и N-модул (NADH дехидрогеназа), които образуват рамото на матрицата, и P-модул (протонно изпомпване), които образуват мембраната- интегрирано рамо.
Биогенезата на CI е сложен процес: 37 кодирани в сърцевината и 7 кодирани в митохондрии субединици образуват множество междинни съединения, които се сглобяват в няколко паралелни и последователни стъпки, за да образуват напълно сглобен комплекс. Впоследствие CI се интегрира в суперкомплекси, в които се свързва или с комплекс III (CIII) -димер (I/III 2-суперкомплекси), или с CIII-димер и едно или повече копия на комплекс IV (CIV, I/III 2/IV n - комплекси от комплекси). 1
Сглобяването на CI зависи от действието на няколко сглобяващи фактора, които са свързани с междинните съединения, но не са част от самия холоензим.
NDUFAF4 (C6ORF66) е категоризиран като фактор за сглобяване на Q-модул, тъй като се асоциира с подсглобки на Q-модул по време на биогенезата. 1 Точната му функция обаче все още не е изяснена. Към днешна дата е описан един вариант на NDUFAF4 в едно семейство, което е повлияло на протеиновата функция. 2 Тук представяме пациент с нов вариант на NDUFAF4, разширяваме фенотипа, свързан с дефицита на NDUFAF4, и анализираме неговата роля в биогенезата на KI.
Материали и методи
Вижте допълнителна информация онлайн.
резултатът
Доклад за случая
Пациентът е първото дете на оцелелите (първи братовчеди) родители от пакистанската етническа група. Той е роден на 38 гестационна седмица след предизвикване на раждане поради опасения относно вътрематочното забавяне на растежа. Той тежеше 2406 g.
На 7-месечна възраст той бе представен на местните педиатрични служби, за да намали своите важни събития. Рядко се усмихваше, не можеше да се преобърне, седеше неподдържан и не се усмихваше. Той беше недисморфно, с недостиг на тегло дете с раздразнителност. Той имаше централна хипотония и нормален до леко повишен тонус на крайниците с лесно предизвикващи се сухожилни коленни рефлекси и без клонинг.
ЯМР на мозъка разкрива дифузни двустранни промени в сигнала в базалните ганглии и таламуса, което предполага синдром на Leigh. ЕЕГ показа общо забавяне с мултифокални скокове, съответстващи на епилептогенното насочване. Няма сърдечно-съдови, бъбречни или чернодробни заболявания.
Анализът на органични киселини в урината разкрива повишени метаболити на лактат, кетони и цикъла на Кребс. Плазменият лактат е 10,6 mmol/l, а CSF лактатът е 6,1 mmol/l (референтен диапазон: 0,8-1,8 mmol/l). Получените от пациента фибробласти на кожата са изследвани за ензимна активност на дихателната верига, която показва изолиран дефицит на CI (32 mU/U цитратна синтаза, референтен диапазон: 163-599) с активност на комплекси II, III, IV и V в рамките на референтния диапазон.
Две години след първоначалния преглед, пациентът все още има дълбоко забавяне в развитието, необходимо е хранене с PEG сонда и той има епизодични припадъци.
Общото секвениране на exom идентифицира варианти в NDUFAF4
Вариант на хомозиготен мисенс в гена NDUFAF4 (NM_014165.3) беше идентифициран чрез секвениране на exom: c.7G> C; стр. (Ala3Pro). Този вариант не се намира в базата данни на ExAC (//exac.broadinstitute.org), базата данни с 1000 генома (//www.internationalgenome.org) или във вътрешната ни база данни. Новият вариант и по-рано публикуваният вариант са качени в „База данни за отворени вариации на Leiden“ (//www.lovd.nl/NDUFAF4): Идентификатори на варианти # 0000170856 и # 0000174214; индивидуални идентификационни номера # 00104960 и # 00107834.
Вариантният софтуер за прогнозиране предсказва различни функционални ефекти от тази мутация: Дегустация на мутатор (//www.mutationtaster.org/): 3 „полиморфизъм“ (вероятност: 0.84); PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/): 4 „вероятно вредно“ (резултат: 0, 991); SIFT (//sift.jcvi.org/): 5 „вредни“ (SIFT резултат 0,04). Подравняването на последователността показа, че обменният аланин в позиция 3 на аминокиселинната последователност се запазва при бозайници (Допълнителна фигура 1).
Вариантът NDUFAF4 води до изолиран дефицит на CI, който може да бъде спасен чрез лентивирусна комплементация с див тип NDUFAF4.
Изпълнено е летивирусно допълване с маркиран на С-терминал V5 див тип NDUFAF4, за да се демонстрира, че вариантът NDUFAF4 влияе върху протеиновата функция (Фигура 1). CI ензимната активност беше спасена чрез допълване с NDUFAF4, но не и чрез симулирана трансфекция с V5-белязан GFP (Фигура 1а). Комплементацията също така спаси намалените нива на холо-Cl, анализирани чрез естествена електрофореза в полиакриламиден гел (BN-PAGE)/имуноблотинг, използвайки митохондриалния протеин 1-додецил-β-D-малтозид (Фигура 1b). Нивата на CI субединици, анализирани чрез електрофореза на полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат (SDS-PAGE), също се увеличават в комплектованите от пациента фибробласти (Фигура 1в). NDUFAF4 не се открива в клетките на пациента.
Изображение в пълен размер
Дефицитът на CI във фибробластите с дефицит на NDUFAF4 причинява променена суперкомплексна стехиометрия
Тъй като CI образува суперкомплекси с CIII и CIV и нивата на последните две не се променят въпреки липсата на CI, анализирахме суперкомплексната стехиометрия. За да се запазят суперкомплексните взаимодействия, митохондриалният протеин се разтваря с мек детергент дигитонин, вместо с n-ододецил-β-D-малтозид и се подлага на BN-PAGE/имуноблотинг. В случай на NDUFAF4-дефицитни фибробласти, липсата на CI доведе до намаляване на I-III 2- и I/III/IV n-супер комплекси (Фигура 2a-c) с повишени нива на димери на CIII и III 2/IV . -суперкомплекси (фигури 2б и в). Забележително е, че нивата на мономерните CIV остават непроменени (Фигура 2в).
Изображение в пълен размер
Дефицитът на NDUFAF4 води до натрупване на междинни съединения на CI, съдържащи компоненти на проксимален P-модул, дистален P-модул и N-модул
Анализирахме ефектите от дефицита на NDUFAF4 върху сглобяването на CI чрез експерименти с 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE при фибробласти на пациента (Фигура 3). В първото измерение на BN-PAGE се отделят естествени протеинови комплекси (т.е. OXPHOS комплекси) (Фигура 1b). Стъпката SDS-PAGE от второ измерение позволява отделянето и подобрената наличност на епитопа за имунодетекция на отделните компоненти на тези естествени протеинови комплекси, включително междинните съединения на CI. В тези експерименти използвахме антитела, насочени срещу представителни компоненти на междинните съединения на всички функционални модули и по този начин срещу всички пътища за сглобяване на CI (Допълнителна фигура 2). Възелите на Q-модула, съдържащи NDUFAF4 или NDUFS3, вече не се откриват във фибробластите на пациента и не се натрупват. Обаче имаше ясно натрупване на проксимални подсекции P-модули, съдържащи факторите за сглобяване ACAD9 и ECSIT, дистални подсглобки P-модул, съдържащи подблока NDUFB11 CI, и подсекции N-модул, съдържащи NDUFV2 CI субединица. Тези дефекти в комплекта бяха отстранени във фибробластите на пациента, допълнени с див тип NDUFAF4.
Изображение в пълен размер
NDUFAF4 е тясно свързан с NDUFAF3, 1, 6, друг фактор при сглобяването на CI, липсата на който води до подобна грешка при сглобяването. 7 Тъй като се смята, че NDUFAF3 участва в мембранното вмъкване на субединици на β-модула, 6 анализирахме разпределението на няколко CI субединици в митохондриални разтворими протеинови фракции и мембранни протеинови фракции на пациентски фибробласти (Допълнителна фигура 3). В контролните и пациентските фибробласти, откритите субединици на P-модула бяха открити в мембранната фракция, но не и в разтворимата фракция.
дискусия
Преди нашия доклад се съобщава само за един вариант на NDUFAF4 (c.194T> C; s. (Leu65Pro)) в едно семейство с няколко пациенти, които са развили енцефалопатия и лактатна ацидоза малко след раждането. Пациентите или са починали през първата седмица от живота поради неконтролируема ацидоза или са развили тежка миопатия, нарушено неврологично развитие и повтаряща се метаболитна ацидоза. ЯМР на мозъка на един пациент на 16-месечна възраст разкрива тежка генерализирана атрофия и демиелинизация на мозъка. Пациенти, преживели неонаталния период, напуснали на 9 до 18 месечна възраст поради нестабилна ацидоза.
Пациентът, описан в този ръкопис, носи нов вариант на миссен NDUFAF4 и проявява синдром на Leigh и забавяне на развитието. Това подчертава неврологичния фенотип, причинен от дефицит на NDUFAF4, добавяйки синдрома на Leigh, определено митохондриално заболяване, към неговия спектър.
Въпреки че дефицитът на комплекс I може да бъде придружен от дефицити на други OXPHOS комплекси, 9 CIII и CIV обикновено са стабилни в случай на дефицит на комплекс I. Въпреки това, тяхното разпределение в тази среда не е проучено при фибробластите на пациентите. Ние показахме, че некомплексните видове CIII и CIV, свързани с I, не се увеличават по същия начин, но са специфично променени, когато образуването на I/III- и I/III/IV n-хелперни комплекси е нарушено.
Ефектите на вариантите на NDUFAF4 върху сглобяването на CI при фибробластите на пациента не са изследвани. 2, 6, 11 Наскоро публикуваният ни подробен модел на сглобяване на човешки CI показа, че процесът на сглобяване на CI отразява неговата модулна архитектура: 1 подединици от различни функционални модули се сглобяват поотделно и повечето интермодулни асоциации не се провеждат, докато не бъдат завършени последните стъпки на биогенезата на CI NDUFAF4 е свързан с междинни продукти за сглобяване на Q-модул. 1 Тази асоциация се формира по време на ранното сглобяване на CI и продължава до последните стъпки на биогенезата, където NDUFAF4 се дисоциира непосредствено преди завършването на CI събранието.
Експериментите с фракциониране не разкриват β-модулни субединици в разтворимата фракция и следователно няма данни за нарушено вмъкване на мембрана във фибробластите на пациента. Въпреки това, предишни проучвания показват, че субединицата β-модул ND1 се разгражда по-бързо в отсъствието на NDUFAF4. 12 По този начин този механизъм не може да бъде напълно изключен, тъй като е възможно нарушена интеграция на мембраната с последващо незабавно разграждане на субединиците.
Показахме натрупването на части от всички модули с изключение на модула Q, с който се свързва NDUFAF4. Натрупването на N- и P-модула може да бъде вторичен ефект поради ограниченото сглобяване на Q-модула. Това обаче може също да означава, че NDUFAF4 е необходим за свързване на отделно сглобените компоненти на P-модула и N-модула към Q-модула. NDUFAF4 най-вероятно се изисква за две стъпки на сглобяване: (i) присъединяване на подмножества P P- b/P D- и Q/PP-a за създаване на подмножество Q/P 1 и (ii) добавяне на N-модул за завършване на CI ( Допълнителна фигура 2).
В заключение, нашето проучване разширява фенотипния спектър, свързан с дефицита на NDUFAF4, и хвърля светлина върху ролята на NDUFAF4 при съставянето на CI. Бъдещите изследвания ще се фокусират върху молекулярния механизъм на действие на сглобяемите фактори.