елементи
абстрактно
Много малко проучвания са анализирали как съставът на микробиома на майката влияе върху развитието на чревната и устната микрофлора на бебетата през първите месеци от живота. Тук микробиозата, присъстваща в червата на майката, влагалището, майчиното мляко, устната кухина и вената на гърдата, е сравнена с червата и оралната микробиоза на техните бебета през първите шест месеца след раждането. Взети са проби от посочените места на тялото от седем майки и девет деца в три различни времеви точки за период от 6 месеца. Всяка проба се анализира чрез секвениране на 16S рРНК гена. Чревната микрофлора на кърмачетата съдържа различни микробни съобщества, които почти не приличат на различни майчински микроби. За разлика от тях, оралната микробиота на бебета показва голяма прилика с микробиозата на майчиното мляко, млечните жлези и устата. Тези резултати показват, че постоянният контакт между микробните общности увеличава тяхното сходство. Повечето оперативни таксономични единици в детските черва и оралната микробиоза също се споделят с чревните черва и устните общности. Разликата между сходството и дела на OTU, споделени между чревната микрофлора на кърмачета и майки, може да бъде свързана с по-ниското разнообразие и следователно конкуренцията в чревната микрофлора на бебетата.
Следователно целта на това проучване беше да се сравни ефектът на различните майчини микробни общности - чревна, вагинална, орална, кърма и млечна жлеза върху развитието на чревната и оралната микрофлора на бебетата през първите шест месеца от бебешката популация. живот.
материали и методи
Проучвателна група и вземане на проби
Бременни жени са били включени в това проучване през първия период на спонтанно започване на раждането или до 24 часа преди платно цезарово сечение с непокътнати околоплодни мембрани. Те бяха записани в отделението за женски клиники в Университетската болница в Тарту между май 2012 г. и септември 2013 г. Всички признати жени са имали неусложнена бременност, не са имали инфекциозни заболявания, изискващи антибиотично лечение, и в миналото не са имали диабет. или хипертонични разстройства през втората половина на бременността. Общо седем майки (средна възраст: 33,1 ± 4,5 години) са осиновени заедно с новородените им (двойки майка-бебе). Две двойки включват близнаци и четирите деца са включени в това проучване. Само една жена не е била многородна (среден паритет, 1,4 ± 0,8). Пет жени родиха с цезарово сечение и получиха профилактично лечение с цефуроксим преди разрез на кожата. Всички новородени са средни (средна гестационна възраст, 38,9 ± 1,6 седмици) и имат нормално тегло при раждане (средно тегло, 3,379,3 ± 564,1 g). Клиничните фактори, описващи двойките майки и бебета, са изброени в допълнителни таблици S1.
Взети са шест вида проби от всяка двойка майки и бебета преди раждането или 48 до 72 часа след раждането, 6 до 8 седмици и 6 месеца след раждането. В допълнение, вагинален тампон се взема от всяка майка преди раждането. Взети са общо 139 проби (фиг. 1). Преди вземане на проби не се използват вагинални или дермални дезинфектанти и измиването на гърдите не се почиства. Всички взети проби се съхраняват при -20 ° C веднага след вземането на пробите.
Брой и вид проби, взети от двойки майка-дете във всеки от посочените моменти от време.
Изображение в пълен размер
Бактериоскопските цитонамазки са направени от отделна проба от вагинален тампон, която е взета от всяка майка преди раждането. Пробите се оцветяват по Gram и се оценяват по метода на Nugent 7: 0-3 (нормално), 4-6 (междинно) и 7-10 (бактериална вагиноза (BV)).
Профилиране на бактериална общност
ДНК беше извлечена с помощта на MoBio PowerFecal ДНК изолационен комплект (Mo Bio, Карлсбад, Калифорния) съгласно инструкциите на производителя. Въпреки това бяха включени допълнителни стъпки за различни типове проби. Накратко, всички проби от тампони бяха първо завихрени за около 10 минути в 750 μl стерилен физиологичен разтвор, буфериран с фосфат (PBS). 400 μl проби от тампони в PBS и 800 μl майчина вода бяха добавени към всяка тръба със сухи топчета. 1 ml майчина кърма първо се центрофугира при 6000 об/мин за 20 минути. Супернатантите се отстраняват и всяка пелета се ресуспендира в 400 μl PBS преди да се прехвърли в отделни епруветки със сухи топчета. След това епруветките се центрофугират при 13 200 об/мин за 30 минути. Супернатантите бяха отстранени и процедурата за MoBio PowerFecal комплект за изолиране на ДНК беше последвана в стъпка 2. ДНК от проби на изпражненията беше извлечена съгласно протокола на производителя. Проби, представляващи един и същ тип микробна общност, образуват една партида за екстракция на ДНК. Екстрахираната ДНК се съхранява при -20 ° С преди анализ.
Амплифицирането на V1-V2 хиперпроменливата област на 16S рРНК се извършва с помощта на баркодове на универсални 27F-YM и 357 R праймери 8. Последователностите на грунда бяха както следва: 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNNN AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3 '(Illumina TruSeq. 3-end adapter) и 5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC TGC TGC CTY CCG TA-3 ′ (последователност от универсален адаптер TruSeq и 357 R в 3 ′ края). Включени условия за усилване: 10 минути при 98 ° C, последвани от 5 цикъла от 30 s при 98 ° C, 30 s при 55 ° C и 45 s при 72 ° C, 30 цикъла от 30 s при 98 ° C и 60 s при 72 ° C и крайна стъпка на удължаване при 72 ° C за 10 минути.
PCR реакциите са имали общ обем 20 μl, с 10 μl Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), 5 μl ДНК шаблон и всеки праймер в концентрация 0.2 μM. PCR продуктите се пречистват с помощта на Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Калифорния, САЩ) и се секвенират със системата Illumina MiSeq в Genome Center в университета в Тарту, Естония (секвениране с един край с помощта на MiSeq v2 комплект и 300 цикъла).
Анализът в реално време на бифидобактерии с DGGE и PCR се извършва, като се използва методологията, описана в допълнителните методи.
Данни и статистически анализ
Софтуерът MOTHUR 1.27.0 е използван за модифициране, отслабване и подравняване на получените последователности за създаване на оперативни таксономични единици (OTU) и присвояване на таксономии. Последователностите бяха изрязани и изхвърлени на базата на качествен резултат от съответно 225 bp. OTU са генерирани с помощта на среден непрекъснат йерархичен алгоритъм на клъстериране с праг на идентичност 97%. Референтни последователности за съвпадащи 16S рРНК генни последователности са получени от базата данни на SILVA рибозомна РНК и са направени сравнения с таксономични разпределения с жив байесов класификатор с 90% граница на доверие. OTUs с по-малко от две последователности и OTUs, присъстващи в по-малко от две проби, също бяха изхвърлени. За да се определи най-вероятното наименование на видовете за основни OTU, картографирани в рода Lactobacillus, беше извършено друго таксономично разпределение на базата данни на NCBI 16S рибозомна РНК с BLASTN.
Всички анализи бяха извършени с помощта на корекция на Holm-Bonferroni. Стойностите на Р под 0,05 се считат за статистически значими.
Етични съображения
Това проучване беше одобрено от Комитета по етична изследователска дейност в университета в Тарту (№ 210T-7) и всеки участник получи писмено информирано съгласие при приемане в отдела за доставка. Всички методи са извършени в съответствие с приложимите насоки и разпоредби.
резултатът
Профилиране на бактериална общност с използване на 16S rRNA секвениране
В това проучване са генерирани общо 1 106 448 висококачествени четения на последователности. Ограничението за минималния брой съкратени последователности, присвоени на пробите, варира от 200 до 1400 в зависимост от типа на общността (Допълнителна таблица S2). При тези граници кривите на разреждане на най-малко 90% от пробите достигат 5% плато. Общо 135 от тези проби и 1 530 OTU надвишават тези гранични стойности и са допълнително анализирани (номера за присъединяване към GenBank за представителни OTU последователности: KP117311-KP118840). Една кърма, една перорална проба на една майка и две перорални проби за кърмачета не надвишават тези граници. Получените OTU са разделени между 12 щама, 89 семейства и 170 рода.
Най-високите стойности на индекса на разнообразие на Шанън се наблюдават в червата на майката и оралната микробиоза и тези общности се различават значително от червата и оралната микробиоза на кърмачета, които имат значително по-ниско микробно разнообразие (p
Графика на корелация, представяща стойностите на индекса на сходство на косинусите между анализираните видове микробни съобщества. Часовете представляват времето за вземане на проби във връзка с раждането на бебета.
Изображение в пълен размер
Неметричното многомерно мащабиране (NMDS) начертава визуализацията на разстоянието на Джакард между проби от анализирани видове микробни съобщества.
Изображение в пълен размер
Относителният брой на най-важните OTU, които колонизират анализираните типове общности.
Изображение в пълен размер
Чревната микрофлора на кърмачетата по време на проучването не споделя никаква прилика с нито един от анализираните видове майчина общност, но се наблюдава голямо сходство между оралната микробиоза на бебета и микробиозата, колонизираща кърмата, гърдата и устната кухина. кухини (фиг. 2). Тези четири типа общности съдържат комбинация от доминиращи OTU, принадлежащи предимно към рода Streptococcus, които присъстват във всяка популация с подобно висока относителна честота (фиг. 4). Изключение правят OTU, които картографират родовете Staphylococcus и Propionibacterium. Тези OTU имат ниско относително изобилие (
Делът на OTU, наблюдаван в чревните агрегати ( A ) и орално ( Б. ) на детски микроорганизми, споделени с майчините типове. * Червата и микробиозата на кърмачетата във всеки анализиран момент се сравняват с вагиналната микробиоза, наблюдавана при майки преди раждането.
Изображение в пълен размер
Средната пропорция с 95% доверителен интервал на OTU, наблюдавана в червата ( A ) на кърмачета и орално ( Б. ) микробиоза, споделена с типовете на общността на майка му (делът, споделен между конкретни двойки майка-дете). * Червата и микробиозата на кърмачетата във всеки анализиран момент се сравняват с вагиналната микробиоза, наблюдавана при майки преди раждането.
Изображение в пълен размер
Червата и микробиозата на кърмачетата не показват значително по-голямо сходство с микробните общности на техните майки, отколкото микробните общности на други майки и сходството не се променя значително по време на проучването (фиг. 7 и допълнителна фигура S2).
Среден индекс на сходство между козите ( A ) и орално ( Б. ) от микробиоза и видовете микробни съобщества на собствената им майка (червени точки) и видовете общност, наблюдавани при останалите майки (Tukey boxplot).
Изображение в пълен размер
Чревен състав на бебето и орална микробиота
Укрепващите ефекти също са били значими при оралната микробиота на бебета по време на проучването (средно относително отклонение [0, 8] [0, 16]) (Допълнителна фигура S3). Долните таксономични нива бяха доминирани от Streptococcaceae (0, 7 [0, 18]), последвани от Pasteurellaceae (0, 08 [0, 09]). Оралната микробиота на бебета е била относително стабилна през периода на изследването (допълнителна фигура S6-C) и е била много сходна при бебета.
В това проучване чревната и орална микробиоза на близнаците в това проучване не показват по-голямо сходство между тези сдвоени братя и сестри, отколкото се наблюдава при други деца (средно [SD] CSI: 0,35 [0,38 срещу 0,32 [0,34] и 0,76 [0,24 ]). срещу. 0,75 [0,22] за чревна микрофлора и орална микробиоза между близнаци в сравнение с други деца). Също така, червата и оралната микробиота на бебета, родени вагинално спрямо цезарово сечение, не показват по-голяма прилика (0,22 [0,16] спрямо 0,35 [0,38] и 0,8 [0,82 срещу 0,73 [0,24].] За чревни и орални микробиоти при бебета, родени вагинално от цезарово сечение).
Състав на микробни съобщества, колонизиращи майки
дискусия
Доколкото ни е известно, това е едно от първите проучвания за анализ на ефекта на майчината микробиоза върху различни части на тялото върху червата на бебетата и микробиозата в устата. Въз основа на изследваните от нас двойки майки и бебета, изглежда, че бебешката микробиоза съдържа силна микробна общност, която почти не прилича на микробиоза, която колонизира червата на майката, вагиналната тъкан, кожата, кърмата и устната кухина през първите шест месеца от живота. живот на детето. За разлика от тях, оралната микробиота на кърмачета, както и микробиозата на майчиното мляко, микробиозата на млечната жлеза и микробиозата на устната кухина, са много сходни помежду си.
Голямото изобилие на Streptococcus OTU, наблюдавано в общностите, колонизиращи майчиното мляко и рак на гърдата, и обилното присъствие на Staphylococcus и Propionibacterium, които са типични колонизатори на човешката кожа 13, в микробиома на кърмата (Допълнителна фигура S6) предполага, че може да настъпи ретроградна. по време на кърмене, както се очаква от Ansicar et al. 9. Тъй като ареолите на гърдите не са били изчистени преди вземането на проби, проучването може да надцени сходството между оралната микробиоза при кърмачета и микробиозата, която колонизира ареолите на гърдата.
В сравнение с други майки, не наблюдаваме по-голямо сходство на микробните общности между кърмачетата и техните майки (фиг. 7). Това може да изглежда изненадващо, като се има предвид, че няколко предишни проучвания са наблюдавали предаване от майка на дете на бактериални щамове 9, 10, но най-вероятно резултатите ни сочат липса на секвенция на 16S rRNA при идентифициране на таксони на по-ниско ниво от род 14. По този начин нашите резултати от анализа на състава на общностите на ниво щам не изключват значителни прилики между отделните двойки майки и бебета (и различен модел на общност от другите майки).
Друго ограничение на това проучване беше малкият размер на пробата, което е най-вероятно причината, поради която не наблюдавахме ефекта от дозировката и режима на хранене върху състава на червата и микробионите при деца. Тези ефекти са добре описани в много предишни проучвания [напр. Литература 6, 10]. Най-голям брой бифидобактериални таксони обаче се наблюдава в чревната микрофлора на близнаци, които са били кърмени за по-кратки периоди и вместо това са получавали пребиотична формула. Този резултат е в съответствие с изследването на Barrett et al. 15, където най-голям брой бифидобактериални щамове и разнообразие са наблюдавани при кърмачета, получаващи пребиотици с формулата (напр. Галактоолигозахариди и полифруктоза) 15 .
В заключение беше установено, че чревната микрофлора на кърмачетата се различава от всички видове майчина общност, анализирани в това проучване, докато оралната микробиота на кърмачетата показва голяма прилика с микробиозата на кърмата и млечната жлеза. Тези резултати подчертават значителното въздействие на продължаващия контакт между тези микробни общности. Установено е обаче, че както детската чревна, така и оралната микробиота имат най-висок дял на OTU със съответния тип майчина общност. Разликата между сходството и дела на OTU, наблюдавана в чревната микрофлора на кърмачета и майки, може да бъде свързана с по-ниско видово разнообразие и по този начин с по-ниска конкуренция в чревната микрофлора на кърмачета, което води до разлика в изобилието от споделени OTU.,
Благодаря
Благодарим на Heili Varendi и Anneli Aus от детската клиника на университета в Тарту за техническата помощ. Това проучване беше подкрепено от Естонския изследователски съвет (грантове № IUT34-19 и IUT34-16), естонското министерство на образованието и научните изследвания (грант № KOGU-HUMB), Европейския съюз чрез Европейския фонд за регионално развитие (SFOS reg. 3.2.0701.11-0023), Enterprise Estonia (грант № EU48695) и иновационната програма „Хоризонт 2020“ (WIDENLIFE, EU692065). Яак Сим финансира изследователския съвет на KU Leuven (GOA/10/09 MaNet, CoE PFV/10/016 SymBioSys) и стипендии за докторантура/постдок от фламандското правителство (IOF, Hercules Stitching, iMinds Medical Information Technologies SBO 2014). Финансиране беше осигурено също от Intel, Janssen Pharmaceutica и Фламандския институт за наука и технологии (IWT).
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.