- елементи
- абстрактно
- Въведение
- Материали и методи
- елементи
- Хирургични процедури
- Наркотици и микроинфузии
- Процедури за тестване на поведението
- Експериментален дизайн
- Проверка на местоположението
- Статистически анализи
- резултатът
- Хистологична проверка на местоположенията и отчитане на обекти, пропуснати от анализите
- Прием на храна и вода
- Хранителен микроанализ
- Muscimol ефекти в AIC
- Muscimol ефекти в vmPFC
- Ефекти от CNQX и AP-5 във vmPFC
- Микроанализ на питейната вода
- Бърза помощ и разплод
- дискусия
- Финансиране и оповестяване
- Допълнителна информация
- Word документи
- Допълнителна информация
- Допълнителна таблица S1
- Допълнителна таблица S2
- Допълнителна таблица S3
- Допълнителна таблица S4
елементи
- Клетъчна сигнализация
- Поведение при хранене
- Остров
- Префронтален кортекс
абстрактно
В това проучване се използват вливания на агонисти на GABA-A рецептор, мусцимол в рамките на мястото, за създаване на "временни лезии" при плъхове vmPFC и AIC. Тогава поглъщането и свързаните с тях двигателни дейности бяха отбелязани в две мотивационни ситуации: плъхове с недостиг на храна, представени със стандартен чау и плъхове, хранени по желание, с вкусен, вкусен коктейл с високо съдържание на захар/високо съдържание на захар. Основната цел беше да се сравнят ефектите от инактивирането на мусцимол върху условията на хранене и на различни места, за да се определи дали някой от тези сайтове има селективна роля в модулирането на експресията на занижена, контролирана от вкуса диета.
Материали и методи
Всички процедури са оценени и одобрени от Комитета по институционални грижи и употреба на животните към Университета на Уисконсин-Медисън и са в съответствие с насоките в Ръководството на NIH за грижа и употреба на лабораторни животни. Устройствата са одобрени от Американската асоциация за акредитация на лабораторни грижи за животните.
елементи
Във всички експерименти са използвани мъжки плъхове Sprague-Dawley, получени от Harlan (Indianapolis, IN) с тегло 275-290 g при пристигане в лабораторията. Плъховете бяха настанени по двойки в прозрачни клетки от поликарбонат (ширина 9,5 инча х 17 инча, дължина 8 инча), с подложки за уши, във вивариум, контролиран за светлина и температура. Животните бяха настанени в цикъл 12:12 ч светлина/тъмнина (светлините бяха включени в 0700 часа). Храната (гранули от плъхове на Agway) и водата са били налични ad libitum, с изключение на фазите за ограничаване на храните в експериментите, както е описано в раздела за експериментален дизайн. Животните се третират ежедневно внимателно, за да се намали стресът.
Хирургични процедури
Наркотици и микроинфузии
Muscimol, CNQX динатрий и AP-5 са получени от Sigma-Aldrich. Лекарствата се разтварят в стерилен 0,9% физиологичен разтвор. В случая на CNQX, физиологичният разтвор се нагрява леко по време на приготвянето на лекарството, за да се повиши разтворимостта. За интрацеребрални микроинфузии плъховете се държат внимателно, инжекторите се спускат с водещи канюли и инфузиите се извършват със скорост 0,32 ml/min. Допълнителни подробности са дадени в допълнителните материали.
Процедури за тестване на поведението
Тестването на поведението се извършва в прозрачни поликарбонатни поведенчески клетки (ширина 9,5 инча х дължина 17 инча х височина 8 инча) с подове от телена мрежа. Експериментите са проведени при две условия: (1) състояние на лишаване от храна, при което в тестова клетка се предлагат предварително претеглени количества челюстни пелети след 20 часа лишаване от храна, или (2) вкусен фураж, в който се предлага течен шоколад аромат на млечен шоколад (наричан по-долу "шоколадов коктейл"). Този коктейл се състоеше от малтодекстрин, захароза, млечни и соеви протеини, царевични и рапични масла, витамини и натурални плюс изкуствени аромати на шоколад (% kcal/порция: мазнини, 29; въглехидрати, 57; протеини, 14). Шоколадовият коктейл се предлагаше от горната измервателна бюрета в тестовата клетка. Водата беше достъпна при всички условия на изпитване от горната обемна бюрета. Плъховете се оценяват чрез експериментално празно третиране с записващо устройство, свързано към компютър. Бяха наблюдавани следните поведения:
Преходи на клетката: движение по централната ос на дългата ос на клетката,
Задни: размножаване на задни крака,
Хранене: непрекъснати пристъпи на хранителни гранули или шоколадов коктейл
Пиене: непрекъснати атаки на водоснабдяване.
Записани са честотата, продължителността и латентността за задействане на всички тези поведения, с изключение на преходите в клетката, за които е записана само честота. За да се запише продължителността на дадено поведенческо събитие, беше натиснат превключвател, който задейства автоматичен таймер (специфичен за това поведение) в началото на поведението. Таймерът е бил изключен, когато поведението е било прекъснато от друго поведение (например плъх, ангажиран в пауза за пиене, е спрял да пие назад или да се разхожда извън клетката амбулаторно). От данните за честотата и продължителността се изчислява общата средна продължителност на всяко отглеждане, хранене или пиене.
Експериментален дизайн
Използвани са две отделни групи плъхове, с инфузионни канюли, насочени към vmPFC (п = 8 плъхове) или AIC (п = 8 плъхове). След възстановяване след операция, на всички плъхове бяха дадени „фалшиви инжекции“, при които инжекционните епруветки бяха вкарани в инфузионни канюли, но не и в мозъка, за да се аклиматизират плъховете за работа и инфузия.
Вечерта на симулирания ден на инжектиране плъховете се поставят в кохорта без храна или в крана за шоколад и кокс. По-конкретно, половината от плъховете във всяка група с мозъчно място бяха поставени на ограничена диета, при която храната се приемаше през нощта, 20 часа преди поведението на следващия ден. На тези плъхове им беше позволено да ядат ad libitum непосредствено след всяка сесия за наблюдение на поведението и по време на временния ден или дни, разделящи сесиите, и след това храната беше премахната отново през нощта преди следващата сесия за тестване. Този график на хранене се поддържа през целия експеримент. Другата половина от всяка група мозъчни сайтове получиха само бутилка шоколадов коктейл (с изключение на обичайната храна) в домашните си клетки през нощта. Това се използва за поставяне на плъховете в нова храна. Отсега нататък плъховете получават шоколадов коктейл само по време на 30-минутни сесии за наблюдение (никога в домашните клетки). Плъховете в петела с шоколад и кока-кола не били лишени от храна.
За по-нататъшна аклиматизация на плъховете към микроинфузия и процедури за тестване, в деня след първото излагане на недостиг на храна или шоколадов коктейл, на всички плъхове се инжектира физиологичен разтвор в съответните им целеви места в мозъка и се поставят в поведенчески клетки с помощта на пелети от чау плюс бутилки с вода (за плъхове с ограничена храна) или бутилки с шоколадов коктейл плюс бутилки с вода (за плъхове ad libitum) за 30 минути. Два дни по-късно започнаха тестове за наркотици.
В дните на тестване за наркотици, плъховете се инжектират с мусцимол (0, 30 или 75 ng) и веднага се поставят в поведенчески клетки. Безусловното двигателно и погълнато поведение бяха наблюдавани и записвани в продължение на 30 минути, както е описано в Процедури за тестване на поведението. На тези срещи на плъховете се предлагаше или храна и вода, или шоколадов коктейл и вода, в зависимост от групирането им. Всеки плъх получава всяка доза според латинските квадратни модели в рамките на индивида. Тестовите дни бяха разделени от поне един временен ден.
След приключване на всички лечения, ограничените групи храни и шоколад бяха разклатени с главата надолу, на плъховете бяха дадени 2 дни, за да се приспособят към новия си график на хранене, и втори път всички дози от лекарството бяха тествани при субектите. Следователно всички дози бяха тествани на всички плъхове при условия на лишаване от храна + чау и ad libitum + шоколад.
Подобен експериментален дизайн беше използван за тестване на ефектите на антагониста на глутаматния рецептор AMPA, CNQX (0, 1, 5 μg/страница) и антагониста на глутаматния рецептор от типа NMDA, AP-5 (0, 0, 1, 1, μg) ./страница). Ефектите на интра-vmPFC CNQX и AP-5 бяха тествани в отделни групи плъхове (n = 8 на група), като редът на чау и шоколадови шейкъри беше балансиран при плъхове, както е описано по-горе. Дозите и на двете лекарства са в рамките на поведенчески активните интрацеребрални дозови граници, съобщени в литературата (Baldwin et al., 2000; Bishop et al., 2011; Mena et al., 2013; Tan et al., 2014).
Проверка на местоположението
В края на всеки експеримент плъховете бяха дълбоко анестезирани с натриев пентобарбитал и перфузирани транскардиално с 0.9% физиологичен разтвор, последван от 10% формалин във фосфатен буфер. Мозъците бяха отстранени и съхранявани в 10% формалин. Коронарните срезове (60 μm) бяха изрязани през мястото на инфузия върху микростат на криостат, събрани на предметни стъкла, оцветени с крезил виолетово и след това проверени, за да се провери правилното местоположение на интракортикалните инжекции. Изображения на представителни секции от всеки експеримент са заснети с помощта на софтуер Scion Image на компютър, свързан към CCD микроскоп Hitachi HV-C20.
Статистически анализи
За интра-vmPFC и интра-AIG проучвания с мусцимол, данните са анализирани с помощта на трифакторни ANOVAs, с един фактор между субектите (мозъчна област) и два фактора в субекта (доза, вид храна). Значителен (P
Илюстрация на местоположението на върха на инжектора в vmPFC (a) и AIC (b) и микрофотография на местоположението във всеки сайт (c, d). а) Черните кръгове представляват местоположения от експеримента с мусцимол, сивите кръгове представляват местоположения от експеримента CNQX, а белите кръгове представляват местоположения от експеримента AP-5. б) Черните кръгове представляват места от експеримента с мусцимол. (в) местоположение на vmPFC; fmi = corups callosum, преден форцепс. г) местоположението на AIC; pir = пириформна кора, ac = предна комисура, LV = странична камера. На панелите (c) и (d) стрелките показват върховете на инжектора.
Изображение в пълен размер
- Изтеглете слайд на PowerPoint
При един от осемте субекта в проучването muscimol/AIG и при двама от осемте плъхове в проучването AP5/vmPFC двустранните местоположения извън целевите зони намаляват; в проучването CNQX два от осемте плъхове се разболяха и бяха жертвани. Всички тези плъхове бяха изключени от анализите.
Прием на храна и вода
Както е показано на фигура 2, инфузиите на мусцимол в AIC предизвикват различни ефекти върху приема в сравнение с интра-vmPFC инфузии (мозъчна област х взаимодействие с доза: F (2, 26) = 3.9, P = 0.022). Допълнителни анализи във всеки мозъчен регион разкриват, че вливането на мусцимол в AIC (но не и в vmPFC) значително намалява приема на шоколадов коктейл (F (2, 12) = 18, 5, P = 0,022, фигура 2г), но не и храна (фигура 2b ). ), както е потвърдено от post-hoc анализи, които показват значителни разлики между свързаните с физиологичен разтвор състави в сравнение с всяка от двете дози мусцимол само за шоколадовия коктейл. За разлика от това, приемът на бебета, предизвикан от лишаване, не е бил повлиян от инфузии на мусцимол в която и да е област на мозъка (Фигура 2а и б).
Прием на храна от кокс и шоколад ("Choc. Shake") след вливания на мусцимол във вентралната средна префронтална кора ("vmPFC"; панели а и в) или агрануларна островна кора ("AIC"; панели b и d)). Дозите мусцимол за двустранни инжекции са дадени в ng/страница. Лентите за грешки представляват една SEM. *** Р
Микроанализ на чревния прием при нехранителни плъхове и прием на шоколадов коктейл при плъхове, които се поддържат според нуждите след инфузии на мусцимол в вентралната медиална префронтална кора (vmPFC) или агрануларна островна кора (AIC). Тук са дадени броят (#) инициирани пристъпи за 30-минутна сесия (панели а и b), общата продължителност на хранене на сесия (панели c и d) и средната продължителност на пристъпите на сесия (панели e и f). Дозите мусцимол за двустранни инжекции са дадени в ng/страница. б) * P + P + P
Прием на парченца, прием на шоколад и микроанализ на храна и прием на шоколад след вливане на AMPA/каинат антагонисти на глутаматния рецептор, CNQX (панели a, c, e и g) или антагонист на глутаматния рецептор NMDA-AP-5 (панели b, d, f и з). Маркировките на оста за микроструктурните мерки са същите, както е описано в легендата към Фигура 3. Дозите за двустранни инжекции с лекарства са дадени в μg/страница. в) * Р
Поведение по време на ходене и размножаване след вливания на мусцимол във вентралната централна префронтална кора ("vmPFC"; панели a и c) или агрануларна островна кора ("AIC"; панели b и d)). Дозите мусцимол за двустранни инжекции са дадени в ng/страница. В панели (а) и (в), * P