сърдечно

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Агенти за инсулинова сигнализация в левокамерната тъкан
  • Медиатори на хипертрофия на лявата камера (LVH) и стрес
  • Експресия на стероидни рецептори
  • Резултати от хистологията
  • дискусия
  • материали и методи
  • Изолиране на РНК и полимеразна верижна реакция в реално време
  • Западно петно
  • Хистопатологичен анализ
  • хистоморфометрия
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Сърдечно-съдова биология
  • Модел на заболяването

абстрактно

В сърдечната хипертрофия 23, 24 са замесени няколко молекулярни медиатори, участващи в инсулиновата сигнализация, като фосфатидил инозитол-3 киназа (PI3K)/протеин киназа В (AKT)/бозайник мишена на рапамицин комплексния сигнен път 1 (mTORC1). Данните от in vitro проучвания 25 показват, че Т задейства сърдечна хипертрофия чрез активиране на mTORC1 пътя. Тъй като пренаталната Т индуцира функционален хиперандрогенизъм и инсулинова резистентност при овце 4, 18, променя инсулиновата сигнализация в черния дроб и мускулите 26, а както Т, така и инсулинът имат потенциал да променят сърдечната функция, предположихме, че пренаталният излишък T също нарушава инсулиновата сигнализация и увеличава инсулина регулиране на инсулина. молекулярни маркери за сърдечна хипертрофия, водещи до неблагоприятно сърдечно ремоделиране.

резултатът

Телесното тегло (kg; средно ± SEM) не се различава между контролните и Т-третираните овце по време на събирането (Т-третирани 69, 4 ± 5, 4 спрямо контрола 63, 09 ± 4, 9 p = 0,40, кохезия d = 0, 44). Нивата на инсулин на гладно (IU/ml; средно ± SEM) при жени, лекувани с пренатална Т, са склонни да бъдат по-високи (T-лекувани 15, 7 ± 4, 7 спрямо контролни 9, 23 ± 2, 12, p = 0,26), с Cohens анализът показва леко увеличение (d) = 0,65). Нивата на глюкоза на гладно (mg/dl; средно ± SEM) са средно 58 ± 3, 9 и 52 ± 1,7 за жени, лекувани с Т, и контролите, съответно (p = 0,28), като анализът на Cohens разкрива малка разлика в размера. d = 0,67)., Съотношението инсулин към глюкоза също има тенденция да бъде по-високо в групата, лекувана с Т (0,25 ± 0,06) в сравнение с контролната група (0,17 ± 0,04), като анализите на Коен показват леко увеличение (d = 0,60) . Теглото на лявата камера на жените, лекувани с Т, обикновено е по-високо, но не се различава статистически от контролните овце (Т лекувани 164,9 ± 9,9 грама спрямо контролни 152 ± 7,2 грама, р = 0,30, кохезия d = 0, 54).

Агенти за инсулинова сигнализация в левокамерната тъкан

Значително увеличение на генната експресия на протеини, участващи в инсулиновия сигнален път, е установено в лявата камера при жени, лекувани с пренатална Т, в сравнение с контролите. Пренаталното излишък T повишава нивото на експресия на IRS-1 6, 4 пъти (p = 0,027), PI3K 8,5 пъти (p = 0,04) и AKT с 27 пъти (p = 0,06) в сравнение с контрола (фиг. 1 ).

Използвани са два t-теста с опашка, за да се тестват разликите между лекуваните с Т и контролните групи и * p е присвоен ap # от 0,06. Анализът на размера на ефекта на Коен разкри големи разлики между лекуваните с Т и контролните групи за гени, участващи в инсулиновата сигнализация ленти (d на Коен: AKT = 1.11, IRS-1 = 1.33, PI3K = 1.29, GSK3b = 0.452). Съкращения: IRS-1 инсулинов рецепторен субстрат 1, PI3K фосфоинозитид 3-киназа, Akt протеин киназа B, GSK3B гликоген синтаза киназа 3 бета.

Изображение в пълен размер

При изходни условия експресията на PI3K протеин (p85 субединица) в лявата камера е значително различна (p = 0,01) между пренатално лекуваната Т (0,023 ± 0,01) и контролните жени (0,019 ± 0,001); и pPI3K също се увеличава (p = 0,008) при пренатално третиран Т (0,01 ± 0,005) в сравнение с контрола (0,008 ± 0,006). Съотношението pPI3K/PI3K не е статистически значимо между групите (пренатално лечение Т: 0,5 ± 0,03 спрямо контрола: 0,45 ± 0,05, р = 0,55). Общо AKT (пренатална T: 0, 40 ± 0, 03 срещу контрола 0, 26 ± 0, 02; p = 0, 007) и pAKT (пренатална T: 0, 26 ± 0, 03 срещу контрола: 0, 18 ± 0, 02; p = 0,028) са значително увеличени при жени, лекувани преди Т, в сравнение с контролата. Съотношението pAKT/AKT (пренатално третирано с Т: 0,65 ± 0,05; спрямо контрола: 0,69 ± 0,04) не се различава статистически между двете групи (р = 0,57). Не видяхме никаква разлика в нивата на протеин на глюкозен транспортер 4 (GLUT 4) между пренатално Т-третирано и контролно (р = 0,33, фиг. 2).

За да се тества разликата между Т-лекуваните и контролните проби, се използва двоен t-тест на Student и * p е присвоен на 25, 27 T in vitro, открит в лявата камера при жени, пренатално лекувани с T, в сравнение с контролните ( p = 0,002). (фиг. 3) и неговата експресия на протеин също се увеличава в лявата камера (общ mTOR: пренатална Т 0, 16 ± 0,02 спрямо контрола 0,11 ± 0,01, p = 0,04; p mTOR: пренатална Т: 0,09 ± 0,008 срещу контрол 0,056 ± 0,004; р = 0,01) (Фиг. 4). GSK3β, важна мишена надолу по веригата на AKT в сърцето, която допринася за потискане на хипертрофичния растеж 28, се различава между двете групи. Общият GSK3 бета е значително увеличен (р = 0,04) при пренатално лекувани жени (6,1 ± 0,57) в сравнение с контрола (4,5 ± 0,4); докато p-GSK3 бета не се различава (p = 0, 16) между пренатално третирани Т (1,99 ± 0,22) и контролни (1,56 ± 0,15) групи. Съотношението p-GSK 3 бета/GSK3beta е значително по-ниско (p = 0,002) при жени, лекувани пренатално с Т (0,32 ± 0,008) в сравнение с контролите (0,35 ± 0,05) (фиг. 4).

Две опашни t-тестове a * при p # за p 0,06 бяха използвани за тестване на разликата между лекуваните с Т и контролните групи. Анализът на размера на ефекта на Коен разкри умерени до големи разлики между третираните с Т и контролните групи за гени, участващи в сигнални пътища. инсулин (d на Коен: mTORC1 = 1,89, aMHC = 1, 20, ßMHC = 0, 89, mTORC1 = 1, 89, BNP = 1, 34, ANP = 0, 61, NFATc3 = 1, 46). Съкращения: mTORC1 Бозайникова мишена на рапамицин комплекс 1, MHC миозин тежка верига, BNP мозъчен естетичен пептид, ANP предсърден естетичен пептид, NFATc3 ядрен фактор активирани Т клетки.

Изображение в пълен размер

За да се тества разликата между третираните с Т и контролните проби, се използва двоен t-тест на Student и е назначен p 29. Пренаталната Т увеличава експресията на гена на NFATc3 3,5 пъти над контрола (p = 0,02, фиг. 3). Измерванията на BNP и ANP, маркери за сърдечна хипертрофия, освободени в отговор на щама на сърдечната стена, показват, че BNP е увеличен 8,2 пъти в групата, третирана преди Т, в сравнение с контролите (p = 0,01, фиг. 3), докато нивата на ANP не се различават между групите (промяна на сгъване 1, 64: p = 0,28).

aMHC, доминиращ миофиламентен протеин на гризачи, за който е доказано, че е променен в модели на сърдечна хипертрофия на гризачи 30, 31, 32, е увеличен 2-3 пъти в групата, третирана с пренатална Т в сравнение с контролите (p = 0,046) (Фиг. 3)., За разлика от ßMHC, доминиращият миофиламентен протеин в лявата камера 33 на възрастен човек не се различава значително (промяна в пъти 2, 2: p = 0, 10) между двете групи.

Експресия на стероидни рецептори

Въпреки че андрогенните и естрогенните рецептори се експресират в левокамерна овча тъкан, пренаталното Т лечение не променя значително експресията на бета или алфа гена на андрогенния рецептор или естрогенния рецептор (AR кратна промяна 0.88 p = 0.40, ER бета кратна промяна 2.2: 2: p = 0, 17, ER алфа многократна промяна 1, 5: p = 0, 64, Фигура 5).

Мащабът на ефекта на Коен откри малки разлики между лекуваните с Т и контролните групи в генната експресия на андрогенни и естрогенни рецептори (AR = 0, 2, ER алфа 0, 26 и ER бета 0, 77) Съкращения: AR андрогенен рецептор, ER естрогенен рецептор.

Изображение в пълен размер

Резултати от хистологията

5 от 8 жени, лекувани с пренатална Т, са имали фокално миокардно разстройство в лявата камера при H&E и Masson оцветяване в сравнение с контролите, които нямат данни за дезарктация на миокарда (Фигура 6а). Пренаталното лечение с Т увеличава размера на кардиомиоцитите в сравнение с контрола (третирани с 15,1 ± 0,4 μm срещу 13,6 ± 0,4 μm, p = 0,02) (Фигура 6b).

( A ) Представителни хистологични разрези на H&E срези от левокамерна тъкан от двегодишни пренатални овце, лекувани с Т (А) и контрола (В). ( Б. ) Ефект на пренаталното лечение с Т върху средната стойност на кардиомиоцитите. * Показва р-стойност 18, 22. Тези нарушения на молекулярната сигнализация могат да доведат до повишена чувствителност към сърдечни увреждания.

mTORC1 е един от ключовите регулатори на протеиновия синтез в кардиомиоцитите и неговото активиране води до сърдечна хипертрофия 41, 42. Той може да се активира от растежни фактори, включително инсулин, чрез неговия сигнален път, както и Т 25, 43. Активирането на протеини след инсулиновия рецептор (PI3K/AKT/mTORC1) се свързва с "физиологична хипертрофия" в сърцето, но има и доказателства за "патологична" хипертрофия с хронично активиране на този път 44, 45, 46, 47, 48, което води до нарушаване на координирания растеж на тъканите и ангиогенезата. Констатациите от това проучване, които показват повишена експресия на mTORC1, PI3K и AKT, предполагат, че пренаталният излишък T може да бъде основата за активиране на сърдечния инсулинов сигнален път, което води до активиране на mTORC1, което в крайна сметка води до сърдечна хипертрофия. Повишената генна експресия на BNP и NFATc3, и двата маркера на патологична хипертрофия, показва неадаптивна хипертрофия.

Тъй като пренаталният излишък на Т води до майчина хиперинсулинемия 49 и постнатална инсулинова резистентност 18 при потомството, вероятно майчината хиперинсулинемия също може да бъде основен играч при програмирането на пренатална Т-индуцирана сърдечна хипертрофия при потомството. Например, увеличаване на PI3K/AKT/mTORC1 сигнализирането се наблюдава при новородени с вродена хиперинсулинемия 50, 51. По същия начин е доказано, че феталната хиперинсулинемия поради майчино затлъстяване води до нарушения на сърдечното програмиране при потомството с повишени маркери на хипертрофия на лявата камера и повишаване на AKT, както и mTOR 52 .

Докато Т може да доведе до сърдечна хипертрофия индиректно чрез програмиране на хиперинсулинемия, потенциалът за директни ефекти на андрогена върху сърдечната хипертрофия не може да бъде пренебрегнат. Тези животни са функционално хиперандрогенни и показват повишена експресия на AR на нивото на хипоталамуса 53, хипофизната жлеза (Cordoso и Padmanabhan, непубликувано) и яйчниците 54. Кардиомиопатия е наблюдавана при новородени с вродена надбъбречна хиперплазия 55, състояние, при което плодът е изложен на прекомерен ендогенен андроген. Андрогенните и естрогенните рецептори присъстват в сърдечната тъкан както в цитозола, така и в ядрото 19. Доказано е, че свързването на половите хормони с техните рецептори води до геномни и негеномни ефекти върху сърцето и един механизъм е активирането на PI3K/AKT 19 пътя, което води до активиране на mTORC1 надолу по веригата, което води до повишен синтез на протеин и в крайна сметка сърдечна хипертрофия 24. Докато андрогенните рецептори се експресират в лявата камера, за да се улеснят директните ефекти на Т, липсата на промени в експресията на AR при жени, лекувани с пренатална Т, предполага, че всички преки ефекти на Т могат да бъдат медиирани от увеличаване на лиганда (Т лечение), а не от рецептор.

Установено е, че Т увеличава усвояването на глюкоза от кардиомиоцитите чрез увеличаване на транслокацията на GLUT4 56 и въпреки че не се наблюдава повишаване на експресията на протеин на GLUT 4 в лявата камера при базални условия, повишената експресия на сигнализиращи протеини на инсулин, включително IRS-1, PI3K и AKT, предполага увеличаване на лявата камера метаболизъм на глюкозата. Свободните мастни киселини са основното гориво за производство на енергия в сърдечната тъкан, но по време на живота на плода и стреса сърцето се връща към глюкозата като основен източник на гориво 57. Повишената генна експресия на протеини, участващи в усвояването на глюкоза при пренатални Т жени, може да показва адаптивна реакция на повишеното метаболитно търсене на сърцето, тъй като наблюдаваме и повишена експресия на BNP, маркер на сърдечния стрес. Повишената експресия на mTORC1 предполага, че Т може да доведе до сърдечна хипертрофия чрез увеличаване на mTORC1, както вече беше предложено 25 .

От транслационна гледна точка тези констатации може да са от значение за потомството на жени с СПКЯ. Доказано е, че нивата на андроген и инсулин са повишени при бременни жени с PCOS 67, 68 и има доказателства, че испанските кохорти раждат деца с намалено тегло при раждане 69. Женските потомци на майки с СПКЯ имат ранни метаболитни нарушения 70, подобни на тези, наблюдавани в нашия пренатален модел Т18, което предполага, че подобно на пренаталния модел на Т-овце, наличието на хиперандрогения при жени с СПКЯ има потенциал да неблагоприятно програмира няколко системи от органи, включително сърдечно-съдовата система.

Накратко, констатациите от това проучване предоставят доказателства за сърдечно препрограмиране при овчи модел на PCOS. По-нататъшните проучвания, които изясняват функционалните последици от такива промени, са жизненоважни и ще подобрят нашето разбиране за въздействието на пренаталния излишък Т върху здравето на сърцето и ще помогнат за разработването на нови стратегии за лечение за предотвратяване на сърдечната податливост към пренатални обиди.

материали и методи

На приблизително 2-годишна възраст, за да се избегнат ефектите от различни нива на ендогенни стероиди, всички животни бяха овариектомизирани и имплантирани с 1 cm дълга SILASTIC капсула (вътрешен диаметър 3,35 mm и външен диаметър 4,65 mm; Dow Corning Corp., Midland, MI) ) заредена със 17β естрадиол (естрадиол; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Приблизително един месец по-късно, два импланта за прогестерон с вътрешно освобождаване на лекарството (InterAG, Hamilton, Waikato, Нова Зеландия) бяха вкарани подкожно във всяко животно. Имплантите на прогестерон бяха отстранени 14 дни по-късно и всички животни получиха четири допълнителни импланта с дължина 3 cm естрадиол, за да постигнат нива на яйчникови стероиди, открити по време на късната фоликуларна фаза. Животните бяха жертвани

20 часа след поставяне на естрадиолови импланти по време на очакваната късна фоликулярна фаза на цикъла чрез прилагане на предозиране с барбитурат (Fatal Plus, Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). Сърцата се събират и части от дясната и лявата камера се замразяват бързо и се съхраняват при -80 ° С до обработка или стабилизиране на формалин за хистологична обработка. Плазменият инсулин и глюкозата са измерени преди евтаназия след 48 часа гладуване. Концентрациите на инсулин се определят чрез радиоимуноанализ (Insulin RIA Kit, MP Biomedicals). Чувствителността на инсулиновия тест е 3.0 μU/l. Концентрациите на глюкоза се определят по метода на глюкозната оксидаза (Pointe Scientific Inc.). Интер-и интра-тестовите CV за тестове за инсулин и глюкоза бяха 90% ефективни. Генно-специфичните праймери са проектирани с помощта на софтуер за избор на праймери и са описани подробно в допълнителния материал в Таблица 1.

Анализът в реално време на SYBR Green PCR се извършва с помощта на генерираната cDNA. На всяка проба беше извършен отрицателен контрол на обратната транскриптаза, за да се изключи замърсяването на изолираната РНК с геномна ДНК. Количествените RT PCR реакции са проведени на Applied Biosystem 7200 PCR инструмент в реално време и са извършени в три екземпляра. Резултатите от теста се определят количествено, като се използват стойностите на праговия цикъл (CT) на всяка проба. Стойностите на CT на всеки ген, който представлява интерес, бяха сравнени със стойностите на битовия ген, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH). Само стойности под 35 се считат за положителни. Резултатите от всеки тест бяха проверени чрез повторение на резултата във втория тест.

Западно петно

Хистопатологичен анализ

Левокамерните тъкани бяха фиксирани във формалдехид в PBS pH 7, 4. След това тъканта беше дехидратирана със серийни алкохоли, пречистена в ксилоли и вградена в парафин. Парафиновите срезове с дебелина 5 μm бяха изрязани и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) за анализ на груб външен вид. Контрастно оцветеният хематоксилинов (PAS-H) перйодат е използван за улесняване на количественото определяне на размера на кардиомиоцитите, използвайки нашата лаборатория за хистопатологични изследвания в Мичиганския държавен университет. Хистологичните разрези бяха изследвани в произволен ред от двама независими ветеринарни патолози, които бяха заслепени за групи за лечение.

хистоморфометрия

Според предварително установени протоколи, 73, 74 средни диаметри на кардиомиоцитите на лявата камера са определени чрез измерване на късата ос на 100 кардиомиоцити в ядрено напречно сечение с почти кръгови капилярни профили в 10 произволно избрани микроскопични полета при 400х увеличение. Измерванията бяха получени с помощта на софтуера CellSens.

Статистически анализ

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Vyas, AK et al. Пренатално програмиране: нежелано сърдечно програмиране поради излишък от гестационен тестостерон. Sci. Представител. 6, 28335; doi: 10, 1038/srep28335 (2016).

Допълнителна информация

Word документи

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.